שימוש קריסטל ויולט כדי לשפר קריאה חזותית אפקט ציטוטופתי מבוסס עבור טיטציה ויראלית באמצעות TCID50 Assays
12 בפברואר 2022
פרוטוקול זה מציג גישה מדויקת ואובייקטיבית לדמיין טיטריוציות ויראליות באמצעות סגול קריסטל, על ידי השוואתו עם מיקרוסקופיה אופטית וכתמים אימונוציטוכימיים.
מטרת הפרוטוקול הזה היא לייצר טיטציה של מלאי וירוסים ולדמיין אותו באמצעות כתמים סגולים קריסטל. כדי לעשות זאת, טיטציה ויראלית כללית תודגם ואחריה הכתמים. טיטציה זו תבוצע בצלחת 96 באר לתקופה של שבעה ימים בארון בטיחות ביולוגית בתוך מעבדה ברמה 2 בטיחות ביולוגית.
כדי לעשות זאת, צלחת 96 באר של קו התא המועדף יהיה זרע באמצעות המדיה המתאימה ולתת לגדול עד confluent. מלאי הווירוס יהיה מדולל באמצעות דילול פי עשרה, על ידי ערבוב 900 מיקרוליטרים של מדיה ו 100 microliters של וירוס, או דילול המתאים. הקפד מערבולת כל צינור כדי להבטיח ערבוב נכון של התקשורת ואת הנגיף ולהימנע שגיאות על דילול.
כתוב את הפריסה של הצלחת שלך בעופרת, כמו גם כל דילול כדי לעזור במהלך תהליך ההדבקה. לפני ההדבקה, לשטוף באמצעות 200 microliters של PBS. הוסף 50 מיקרוליטרים של האינוקולום שלך בבארות המתאימות.
לאחר מכן, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%CO2 במשך שבעה ימים. לאחר הדגירה בת שבעת הימים, יש לשטוף בעזרת 200 מיקרוליטרים של PBS. תקן את התאים על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים לבאר של PFA ב 4% ב- PBS ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה, לשטוף תאים שוב פעמיים עם 200 microliters של PBS לפני תוספת של 50 microliters לכל באר של סגול קריסטל במים ודגרה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שאפו סגול קריסטל מן בארות ובאופן אופציונלי, להשאיר את הצלחות לאוויר יבש במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורת החדר או לשטוף אותו עם 200 microliters של מים כדי להסיר כתם מוגזם לפני הדמיה. כתוצאה מכך, לאחר הכתמה מחדש, תאים שליליים יהיו מוכתמים.
בארות חיוביות ינוקו. מידע זה ישמש באחת משתי הנוסחאות המתוארות לחישוב הצמיג הנגיפי הסופי שלך. כאשר הטייטר שהושג עם כל שיטה הושווה, זה הראה כי במונוציטו כימיה כתמים יכול במקרים מסוימים לזהות בארות חיוביות נוספות בהשוואה סגול קריסטל, וכי כמו כן, שתי שיטות הכתמה יכול לזהות בארות חיוביות יותר מאשר הערכה חזותית באמצעות מיקרוסקופיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים שיטה מדויקת להדמיית טיטראציות נגיפיות באמצעות צביעה ב-crystal violet. הוא משווה שיטה זו למיקרוסקופיה אופטית ולצביעה אימונוציטוכימית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- וירולוגיה
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מעבדה
רקע
- טיטרציה נגיפית היא חיונית לכימות של מלאי נגיפים.
- צביעה ב-Crystal violet מספקת ייצוג חזותי של נוכחות נגיפית.
- השיטות ההשוואתיות כוללות מיקרוסקופיה אופטית וצביעה אימונוציטוכימית.
- טכניקות דילול נכונות הן קריטיות לקבלת תוצאות מדויקות.
מטרת המחקר
- להפקת טיטרציה של מלאי נגיפים.
- לוויזואליזציה של הטיטרציה באמצעות צביעה בקריסטל ויולט.
- להבטחת דיוק בשיטות כימות נגיפי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זריעה של שורת תאים מועדפת בלוחית בעלת 96 בארות.
- ביצוע דילולים עשריים של מלאי הווירוס.
- ערבוב בכל דילול באמצעות וורטקס להבטחת ערבוב נכון.
- צביעה ב-crystal violet לאחר תקופת דגירה של שבעה ימים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של טיטראציות נגיפיות באמצעות קריסטל וייולה.
- השוואה עם שיטות צביעה אחרות הראתה עקביות.
- הושגה כמות מדויקת של מלאי הנגיפים.
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה למחקרים עתידיים.
מסקנות
- צביעה ב-Crystal violet היא שיטה יעילה לוויזואליזציה של טיטראציות ויראליות.
- הפרוטוקול משפר את הדיוק של הכמות הוויראלית.
- ניתן להמשיך מחקרים נוספים המבוססים על שיטה זו עבור יישומים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טיטרציה ויראלית מדויקת היא קריטית לסריקה אנטי-ויראלית ולפיתוח חיסונים, שבהם זיהוי לא עקבי של CPE עלול לפגוע בזיהוי מועמדים פוטנציאליים (lead identification) ובקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go). צביעה ב-Crystal violet מהווה חלופה חסכונית וניתנת לשחזור לצביעה אימונוציטוכימית, ובכך משפרת את סטנדרטיזציית הבדיקה ומפחיתה את השונות בתהליכי גילוי מוקדמים. הדבר תומך בביטחון חיזוי בהערכות יעילות אנטי-ויראלית ומאפשר סריקה רחבת-היקף (high-throughput) הניתנת להרחבה, המבוססת על TCID50, עבור וירוסים הגורמים ל-CPE.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר כימות אובייקטיבי של זיהומיות נגיפית, ובכך מפחית את ההסתמכות על מיקרוסקופיה סובייקטיבית ותומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות אנטי-ויראליות.
- ערך תפעולי: מספק שיטת צביעה מהירה וזולה המגבירה את תפוקת הבדיקה ואת ההדירות בתיקוף פגיעות (hits) אנטי-ויראליות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: יוצר נקודות סיום ברורות וכמותיות עבור בדיקות TCID50, ובכך משפר את יחס האות לרעש במסעות סריקה של תרכובות.
- ערך תפעולי: מייתר את הצורך בריאגנטים יקרים עבור ICC, ובכך מפחית את העלות לכל בדיקה ומאפשר יישום רחב יותר בפלטפורמות לגילוי תרופות אנטיויראליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מדידות עקביות של תיתור ויראלי לאורך מחקרים שונים, ובכך תומך במידול מהימן של תגובה למסה במחקרי יעילות פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הכנת מלאי ויראלי בין מעבדות שונות, ובכך מפחית את השונות הבין-ניסויית במחקרי תמיכה ב-IND.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו נכללת ברצף גילוי התרופות הנוגדות וירוסים, החל מאישור ראשוני של "להיטים" (hits) ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות (leads), כאשר תיחוץ (titration) ויראלי מדויק מספק מידע על קשרי מבנה-פעילות (SAR) ואפיון עמידות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי אספקת מודלים הדירים של חשיפה נגיפית למחקרי מנגנוני פעולה.
- סריקה: מספקת תוצאות סטנדרטיות וכמותיות החיוניות למעבר משלב ה-hit לשלב ה-lead במסלולי סריקה אנטי-ויראליים.
- אנליטיקה: מאפשרת חישוב מדויק של ערכי TCID50, המאפשר השוואה מדויקת של עוצמת התרכובות בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מבטיחה רצף בין סריקה אנטי-ויראלית in vitro למודלים של חשיפה in vivo באמצעות כימות עקבי של מלאי הנגיפים.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצגת יכולת ניתנת להרחבה ובעלת עלות נמוכה, הישמה על מטרות נגיפיות ותחומי טיפול מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ביעילות אנטי-ויראלית על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות מהערכה ויזואלית של CPE.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות TCID50 באמצעות צביעה סטנדרטית ומפושטת.
- ערך אסטרטגי: משפר את ניצול ההון בתוכניות אנטי-ויראליות על ידי הורדת עלויות הבדיקה מבלי להקריב את איכות הנתונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת נתוני titer ויראליים מהימנים עבור קריטריונים של go/no-go.
שיקולי יישום
- דורש הכשרה בסיסית בוירולוגיה וטכניקה אספטית לטיפול בטוח בוירוסים בסביבות BSL-2.
- תלוי בציוד מעבדה סטנדרטי הכולל אינקובטורים, צנטריפוגות וקוראי לוחות (plate readers) לצורך כימות אופציונלי.
- מחייב הסכמה בין צוותים על משך הצביעה ופרוטוקולי השטיפה כדי להבטיח הדירות בין מעבדות.
- ישים עבור שורות תאים adhered התומכות בהיווצרות CPE; ייתכן שיהיה נדרש תהליך אופטימיזציה עבור וירוסים שאינם גורמים ל-CPE או עבור תאים שאינם adherent.
- מוגבל לוירוסים הגורמים לאפקט ציטופתי גלוי; לא מתאים למודלים של זיהומים עמידים (persistent) או שאינם ציטופתיים ללא ביצוע התאמות.
