בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות של פוטנציאל ממברנה למחקר פונקציונלי בתפוקה גבוהה של שתי תעלות יונים אנדוגניות בשני קווי תאי אפיתל

בדיקות פוטנציאל ממברנה מבוססות פלואורסצנטיות מספקות שיטות חזקות לחקר ההשפעות של מודולטורים על תעלות יונים המתבטאות אנדוגניות בתאי אפיתל. כהוכחת היתכנות, אנו מודדים את תפקודן של שתי תעלות יונים בקווי תאי אפיתל ידועים. בדיקה זו היא רב-תכליתית, שכן היא משתמשת בבדיקה כימית אקסוגנית כדי למדוד את תפקוד תעלת היונים, ובכך עוקפת את הצורך בבדיקות מקודדות גנטית.

בדיקות אלה בעלות תפוקה גבוהה יכולות לזהות ולאפיין את ההשפעות של מודולטורים של מולקולות קטנות על תעלות יונים, שיש להם פוטנציאל לקדם טיפולים לסיסטיק פיברוזיס. בתור התחלה, תרבית תאי Calu-3 ו-Caco-2 בבקבוק T75 המכיל EMEM עם 20% נסיוב בקר עוברי וסטרפטומיצין 1%פניצילין. שאפו את התווך מבקבוק T75 לאחר שהתאים מגיעים למפגש של 80% עד 100%.

לשטוף בעדינות את התאים עם 10 מיליליטר של מלוחים חוצץ פוספט. לאחר מכן, הוסף 2 מיליליטר של 0.25% טריפסין שחומם מראש, עם 0.1% EDTA, לחד-שכבה של התא. מניחים את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס במשך כחמש דקות.

בשלב זה, ודא שהתאים מתרוממים מפני השטח של הבקבוק ומתנתקים לתרחיף התא הבודד. הוסף 8 מיליליטר של מדיום תרבית כדי לנטרל את התגובה. כאשר התאים מגיעים למפגש של 30% עד 40%, מוסיפים 1.5 מיליליטר של תרחיף התא ל-18.5 מיליליטר של מדיום תרבית בצינור חרוטי ומערבבים.

הוסף 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים זה לכל באר של צלחת 96 באר כדי לקבל כ 140, 000 תאים לכל באר. כדי צלחת אחת מלאה 384 באר, להוסיף 1 מיליליטר של תרחיף התא ל 17 מיליליטר של מדיום התרבית בצינור חרוטי כדי לקבל כ 50, 000 תאים לכל באר. לאחר ערבוב, להוסיף 50 מיקרוליטר של השעיית התא לכל באר.

החליפו את התווך כל יומיים וודאו שהתאים מגיעים למפגש של 100% תוך שלושה עד חמישה ימים בכל הבארות בו זמנית. שנה את המדיום 24 שעות לפני הלימודים הפונקציונליים. ראשית, הכינו את תמיסת החיץ נטולת הנתרן ונטולת הכלוריד עם הריאגנטים המפורטים בפרוטוקול הטקסט.

הוסיפו את הריאגנטים למים בזיקוק כפול בדרגת תרבית רקמה. הניחו לריאגנטים להתמוסס על ידי ערבוב לילה בטמפרטורת החדר. לאחר שהפתרון יציב, התאם את ה- pH ל- 7.4 על ידי הוספת תמיסת NMDG מולרית אחת טיפתית.

מערבבים במשך 30 דקות ומתאימים את האוסמולריות של התמיסה לטווח של 300 פלוס או מינוס 5 מילימולים לקילוגרם. סנן ואחסן את תמיסת החיץ בבקבוקים סטריליים. לאחר מכן, יש להמיס 0.5 מיליגרם של צבע פוטנציאלי של הממברנה במיליליטר אחד של חיץ נטול נתרן וללא כלוריד ולחמם את התמיסה ל-37 מעלות צלזיוס.

הסר את מדיום התרבית מחד-שכבות התאים Calu-3 ו- Caco-2. הוסף 195 מיקרוליטר של תמיסת הצבע לכל באר עבור צלחת 96 בארות, ו 95 מיקרוליטר לכל באר עבור צלחת 384 באר. אפשרו לתאים לטעון את הצבע במשך 35 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן, בצע מדידות פלואורסצנטיות עם עירור ב 530 ננומטר ופליטה ב 560 ננומטר. בתחילה, בצע קריאות בסיס רציפות במשך חמש דקות במרווחים של 30 שניות. לאחר מכן, הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת פורסקולין 400 מיקרומולרית לכל באר של צלחת 96 באר, כדי לקבל ריכוז פורסקולין סופי של מיקרוטוחן אחד.

עבור צלחת 384 באר, להוסיף חמישה מיקרוליטר של 20 תמיסת פורסקולין מיקרומולרית. קח דירוג גירוי במשך 20 דקות עם מדידות במרווחים של 15 שניות. לאחר מכן, הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסה 400 מיקרומולרית של מעכב CFTR לצלחת 96 באר, כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מיקרומולרית.

לצלחת 384 באר, להוסיף 5 מיקרוליטר של 200 מעכב CFTR מיקרומולארי. בצע קריאת עיכוב במשך 15 דקות עם מדידות במרווחים של 30 שניות. כמת את מדידות עוצמת הפלואורסצנטיות של כל באר וייצא את הערכים כגיליון אלקטרוני.

בתבנית עמודה, המכילה בארות בודדות. כדי לחשב שינויים הנגרמים על ידי פורסקולין, חלקו את מדידות יחידת הפלואורסצנטיות היחסיות מכל באר של לוח 96 הקידוחים במדידת עוצמת הפלואורסצנטיות האחרונה של קריאת קו הבסיס, והתוו אותן. מדוד את תגובות השיא כעוצמת הפלואורסצנטיות המרבית שנמדדה מקו הבסיס במהלך גירוי פורסקולין.

השתמש במדידה זו, או באזור שמתחת לעקומה, כדי לכמת את תגובת CFTR. פונקציית CFTR זוהתה כדפולריזציה של הממברנה לאחר גירוי פורסקולין בתאי Caco-2. פלואוריד זוהה כעלייה חדה בפלואורסצנטיות בהשוואה ל-DMSO כבקרת הרכב.

לאחר גירוי פורסקולין, האות הפלואורסצנטי נשמר עד להוספת מעכב CFTR, ולאחר מכן חלה ירידה מהירה בעוצמת הפלואורסצנטיות. תופעה זו הייתה ניתנת לשחזור הן בתאי Caco-2 והן בתאי Calu-3. פעילות CFTR חושבה כהפרש בשינוי המקסימלי בפלואורסצנטיות לאחר גירוי פורסקולין או DMSO.

נקודות בודדות נעו בין פלוס או מינוס 3 סטיות תקן מהממוצע במקרה של גירוי פורסקולין ובקרת DMSO, מה שמצביע על יכולת השחזור של הבדיקה. כדי לאשר את הספציפיות של תגובות פונקציונליות, ניתן לאמת עוד יותר את בדיקות פוטנציאל הממברנה הללו באמצעות שיטות אלקטרופיזיולוגיות קונבנציונליות, כגון תא שימוש. פלטפורמה זו מסוגלת לגשר על הפער בין מסכי אפנן בעלי תפוקה גבוהה ומערכות ביטוי הטרולוגיות לבין מדידות ביואלקטריות הגוזלות זמן רב ברקמות ראשוניות קשות לגישה.