ניתוח השוואתי של מבנה RNA של תעתיקים צעירים ובוגרים ב-Saccharomyces cerevisiae
27 בפברואר 2026
המבנה המשני של ה-RNA נצפה בעיקר ב-RNA בוגר בשיטות בדיקת מבנה. רצף מעקב מבנה קו-טרנספריפליונלי (CoSTseq) מאחד את ריצת הגרעין, ששימשה לחקר מיקום הפולימראז על RNA מתהווה, עם חקירת מבנה. כך CoSTseq מאפשר תצפית על מבנה ה-RNA המשני ב-RNA תחת שעתוק פעיל.
חקרנו עיבוד RNA קוטרנספריפטוני, וזה כולל כיצד RNA מתפתח כשהוא יוצא מה-RNA פולימראז שמסנתז אותו. לפני השיטה הזו, לא יכולנו לעקוב אחרי קיפול ה-RNA במהלך הסינתזה, וזה עיכב אותנו במחקר שלנו. אז השיטה החדשה הזו מתגברת על הפערים האלה.
CoSTseq פותחה כדי לחקור קיפול RNA מתהום בשמרים. הוא יעיל במיוחד לניתוח RNA בשפע גבוה. כדי להתחיל, יש לחסן את זן Saccharomyces cerevisiae BY4741 ב-50 מיליליטר של מדיום YPAD ולדגור ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור במהירות של 200 סיבובים לדקה עד שהתרבית מגיעה לשלב אמצע הלוגריתם.
לאסוף כשלושה מיליליטר של תרבית שמרים בצפיפות אופטית של 1.8 יחידות וצנטריפוגה בטמפרטורה של 2,500 x גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה מקוררת מראש. זרוק את הסופרנטנט למיכל פסולת. החזירו את הכדור ל-10 מיליליטר של PBS קר וצנטריפוגה שוב ב-2,500 x g למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הסר את הסופרנטנט והשאיר את כדור השמרים על קרח. החזירו בזהירות את כדור השמרים ל-10 מיליליטר של סרקוסיל קר 0.5% ללא בועות. דגרו את השמרים המוחזרים על קרח במשך 20 דקות כדי לאפשר חדירה, ואז גררו את התאים בטמפרטורה של 400 x גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והחזירו את תאי השמרים החדירים ב-100 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז באמצעות פיפט P-1000.
הכינו תמיסה עובדת של בופר שעתוק 2.5X עם דיתיותרייטול עם חמישה מילימולר שנוספו זה עתה, וחממו מראש את בופר הבדיקה המבנה של 2.5X ל-30 מעלות צלזיוס. בצינור נקי בנפח שני מיליליטר, הוסף את כל רכיבי התגובה הנדרשים וערבב היטב. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר מתאי השמרים המוכנים לצינור התגובה ודגרו אותם במערבל התרמי בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, עם ניעור במהירות של 500 סיבובים לדקה למשך שתי דקות.
לאחר מכן הוסף במהירות 200 מיקרוליטר של בופר המבנה 2.5X שחומם מראש, ו-25 מיקרוליטר של תגובת דימתיל סולפט בו-זמנית. סחרור את הצינור בעדינות בשני פולסים והחזר אותו לאינקובטור עם 30 מעלות צלזיוס ו-500 סיבובים לדקה. המשיכו לדגור על המיקסר התרמי במשך ארבע דקות, עם מרווח של 30 שניות בין הדגימות.
הכינו את בופר העצירה והשטיפה מראש והניחו אותם על קרח עד השימוש. עצור את מתילציית דימתיל סולפט על ידי הוספת מיליליטר אחד של בופר עצור לצינור התגובה. כעת צנטריפוגה את הדגימות המסומנות עם דימתיל סולפט בעוצמה 3,500 x g למשך חמש דקות בצנטריפוגה לפני קירור.
לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט למיכל פסולת מתאים. הוסיפו מיליליטר אחד של בופר שטיפה מקורר לפלט והחזירו את הכדור. חזור על הצנטריפוגה ב-3,500 x גרם במשך חמש דקות.
המשך מיד להפקת RNA ואל תקפיא את כדור השמרים. החזירו את כדור השמרים המסומן בדימתיל סולפט ב-600 מיקרוליטר של בופר ליזיס RNA, ואז העבירו את ההשעיה לצינור המכיל 40 מיקרוליטר של 20% נתרן דודציל סולפט. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, עם ניעור במהירות של 950 סיבובים בדקה.
לאחר מכן, בצע חילוץ פנול-כלורופורם של RNA בהתאם להליך הסטנדרטי. מערבולות את חרוזי הסטרפטווידין המגנטיים והעבירו 44 מיקרוליטר מהחרוזים לצינור חדש עבור כל דגימה של 80 מיקרוגרם RNA כולל. הנח את החרוזים המגנטיים על מתקן מגנטי עד שהחרוזים מתיישבים.
לאחר הסרת בופר האחסון, החזירו את החרוזים למיליליטר אחד של בופר לפני שטיפה A. כעת דגרו את המתלה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, ואז מגנטיזים והסירו את הסופרנטנט. לאחר הכביסה, תלו מחדש את החרוזים ב-88 מיקרוליטר של בופר קישור 2X. העבר 80 מיקרוליטר מהמתלה לצינור סטרילי בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 80 מיקרוגרם של דגימת RNA ביוטינילציה ב-80 מיקרוליטר.
סובב את תערובת הדגימה על סיבוב במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מניחים את הצינור על המדף המגנטי כדי לאסוף את הזרימה המכילה RNA בוגר ולשמור אותו למשקעים לביצוע בחירת RNA בוגרים באמצעות זרימת עבודה של DMS-MaPseq. לאחר מכן, שטפו פעמיים את קומפלקס ה-RNA שנולד עם 500 מיקרוליטר של בופר מלח גבוה.
לאחר מכן שטוף פעם אחת עם 500 מיקרוליטר של בופר קישור 1X, ואחריו שטיפה אחרונה עם 500 מיקרוליטר של בופר מלח נמוך. עכשיו הוסיפו 300 מיקרוליטר של RNA לקומפלקס החרוז=המתהווה, החזירו אותו היטב ודגרו על המיקסר התרמי במשך חמש דקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו 60 מיקרוליטר של כלורופורם, מערבולת, ודוגרו במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
צנטריפוגה את הדגימה בעוצמה של 14,000 x גרם למשך חמש דקות בצנטריפוגה שלפני הקירור. לבסוף, להעביר את הפאזה המימית העליונה של כ-180 מיקרוליטר לצינור איסוף חדש. השליכו את הפאזה האורגנית שנותרה, והשאירו מאחור את החרוזים והתמיסה המימית שנותרה.
לאחר טיהור ה-RNA המתהווה, בצע תעתיק הפוך בהחלפת תבניות, קשור את מתאם ה-5' ובחר ספריות לריצוף. ההמחשה של מוצרי PCR הניסיוניים על ג'ל 1% אגרוז הראתה היווצרות דימר פריימר מינימלית ומריחת בסיס אופיינית של כ-300 זוגות בסיסים למעקב אחר רצף מבני קו-שעתוק או ספריות CoSTseq ו-DMS-MaPseq. האלקטרופרוגרמה של דגימת CoSTseq אחת אישרה את התפלגות גודל הספרייה עם שיא של סביב 285 זוגות בסיסים.
יישור קריאה של mRNA ב-ASC1 חשף כי ספריית CoSTseq כללה כיסוי על פני האינטרון, מה שמאשר שה-RNA הוא בתחילת דרכו. לעומת זאת, ספריית DMS-MaPseq חסרה כיסוי אינטרונים, מה שמעיד שה-RNA בוגר. מטריצת קיפול השעתוק של 18S pre-rRNA גילתה כי תגובתיות ה-DMS הראתה שינויים פתאומיים כאשר פולימראז ה-RNA התקדם ממיקום 790 ל-811 לאורך מיקום ה-rDNA.
ניתוח תגובתיות DMS של mRNA ADH1 הראה פרופילים דומים בין צורות מתהוות ובוגרות, מה שמעיד על אזורים של יציבות מבנית. לעומת זאת, mRNA ב-SSA2 הציג אזורים של תגובתיות DMS שונה בין צורות מתחילות לבוגרות, מה שמרמז על שינויים מבניים במהלך ההבשלה. באמצעות CoSTseq, חוקרים יכולים לקבוע מבנים משניים של RNA מתפתחים ב-vivo ומיקום ה-RNA פולימראז לאורך תעתיקי ה-RNA.
ל-CoSTseq יש שלבים רגישים לזמן, משתמש בכימיקלים רעילים. עדיף לעבד לא יותר משתי דגימות בו זמנית. מתוך סך ה-RNA שנוצר מ-CoSTseq, ניתן להשתמש ב-RNA לא ביוטינילציה לחקירת מבנה בוגר במקביל באמצעות DMS-MaPseq המסורתי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג את שיטת Co-transcriptional Structure Tracking sequencing (CoSTseq), שיטה לבדיקת המבנה השניוני של RNA ראשוני (nascent RNA) בעת יציאתו מה-RNA polymerase ב-Saccharomyces cerevisiae. CoSTseq מאפשרת מיפוי סימולטני של מיקום ה-RNA polymerase ומצב זיווג הבסיסים של ה-RNA, ובכך היא מתגברת על מגבלות קודמות בחקר תמלילים ראשוניים חולפים בעלי שכיחות נמוכה. הפרוטוקול מאפשר גם ניתוח מקבילי של מבני RNA בוגרים באמצעות DMS-MaPseq.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של RNA
- גנומיקה מבנית
- גנטיקה מולקולרית
רקע
- מבנים שניוניים של RNA הנוצרים במהלך השעתוק משפיעים על ביטוי גנים, עיבוד RNA, תרגום ויציבות.
- שיטות מסורתיות מנתחות בעיקר RNA בוגר, מה שמותיר את קיפולי ה-RNA הנולד (nascent RNA) כנושא שאינו מובן דיו.
- מולקולות של nascent RNA הן נדירות וארעיות, מה שהופך את בידודן ואת האפיון המבני שלהן למאתגרים.
- הבנת הקיפול הקו-שעתוקי (cotranscriptional folding) היא קריטית להבהרת התפקוד והבקרה של RNA.
מטרת המחקר
- לפתח ולהדגים פרוטוקול ללכידת המבנה של RNA נבט (nascent RNA) in vivo.
- לקבוע בו-זמנית את מיקום ה-RNA polymerase ואת מצב זיווג הבסיסים של ה-RNA במהלך השעתוק.
- להשוות בין מבני RNA נבט למבני RNA בוגר במסגרת ניסויית אחת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול והכנה של תרביות S. cerevisiae.
- ביצוע transcriptional run-on עם שילוב biotin-NTP לצורך עיכוב של RNA polymerase באתרים פעילים.
- טיפול ב-DMS (dimethyl sulfate) למתילציה של נוקלאוטידי A, C ו-U שאינם בזיווג ב-RNA.
- העשרה של RNA בתהליך סינתזה (nascent RNA) מבוססת ביוטין באמצעות חרוזי מגנט של streptavidin.
- מיצוי RNA, שעתוק הפוך (reverse transcription) עם template switching, והכנת ספרייה לריצוף.
- תהליך עבודה מקבילי של DMS-MaPseq לניתוח מבנה של RNA בוגר.
תוצאות עיקריות
- ספריות CoSTseq הראו כיסוי על פני אינטרונים, מה שמאשר לכידה של RNA עובד (nascent RNA), בעוד שספריות DMS-MaPseq היו חסרות כיסוי של אינטרונים, דבר המעיד על RNA בוגר.
- פרופילי תגובתיות DMS חשפו שינויים מבניים פתאומיים ב-18S pre-rRNA ככל ש-RNA polymerase התקדם לאורך הגן.
- mRNA של ADH1 הראה תגובתיות DMS דומה בצורות העובדות והבוגרות, מה שמרמז על יציבות מבנית.
- mRNA של SSA2 הראה הבדלים בתגובתיות DMS בין הצורות העובדות והבוגרות, דבר המעיד על עיצוב מבני מחדש במהלך ההבשלה.
מסקנות
- CoSTseq מאפשר מיפוי in vivo של מבנים שניוניים של RNA ראשוני (nascent RNA) ושל מיקומי RNA polymerase.
- השיטה מספקת תובנות לגבי קיפול RNA תוך כדי שעתוק (cotranscriptional RNA folding) ומעברים מבניים במהלך הבשלה של RNA.
- ניתן לבצע CoSTseq לצד DMS-MaPseq לצורך ניתוח מקיף של דינמיקת מבנה ה-RNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ריצוף למעקב מבני תוך-שעתח (CoSTseq) מאפשר ניתוח ישיר של קיפול RNA ראשוני ושל מיקום הפולימראז in vivo, ובכך נותן מענה לפער קריטי בהבנת הדינמיקה של מבנה ה-RNA במהלך השעתח. יכולת זו מגבירה את הביטחון בחיזויים במחקרי בקרה גנטית ותומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלב תיקוף המטרה. שילוב של ניתוח מבנה RNA ראשוני ובוגר מסייע לקבלת החלטאות בשלבים מוקדמים של הגילוי ולמיון תיקי פיתוח של תרופות המכוונות ל-RNA.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מצבי קיפול של RNA בעוד התעתקים יוצאים מה-RNA polymerase.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי מיפוי מעברים מבניים הרלוונטיים לבקרה גנטית.
- משפר את רמת הוודאות החזויה בהיפותזות טיפוליות המכוונות ל-RNA.
- מסייע בסינון ותיעוד של תיקי תרופות על ידי הבחנה בין אזורי RNA יציבים לאזורים דינמיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכי נתונים מאוששים של מבנה RNA עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות אספקת פרופילי תגובתיות כמותיים של DMS.
- תומך ביכולת השחזור באמצעות ניתוח מקבילי של תמלילים ראשוניים (nascent) ובשלים.
- מקל על הערכה מהימנה של השפעות תרכובות על מבנה ה-RNA.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את ניתוח מבנה ה-RNA למערכות ביטוי גנים הרלוונטיות למחלה.
- מספקת רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של מנגנונים המכוונים ל-RNA.
- מאפשרת קידום מותאם סיכונים על ידי חשיפת עיצוב מבני מחדש במהלך הבשראת ה-RNA.
- תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית עבור אסטרטגיות טיפוליות מבוססות RNA.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
CoSTseq משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות מוקדמת דרך זיהוי מובילים (lead identification) ומחקר פרה-קליני, ומאפשר ניתוח מקיף של מבנה RNA בשלבים מרובים של תהליך העבודה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות מיפוי קיפולי RNA ראשוני (nascent) in vivo.
- סריקה: מספק פלטי תגובתיות DMS כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות של הבדיקה.
- אנליזה: מספק נתוני רצף מקצוות זוגיים (paired-end) להשוואת מצבים מבניים לאורך הבשלה של תמלילים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין דינמיקה של מבנה RNA לבין ביטוי גנים רלוונטי למחלה והתאמת סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לניתוח מבנה RNA על פני מטרות ותנאים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי המכוון ל-RNA.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקת מבנה RNA באמצעות זרימות עבודה ניתנות להרחבה ולהקבלה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות יעילה יותר לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ויעילות הון על ידי הבהרת מעברים מבניים של RNA.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות המכוונות ל-RNA.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביולוגיה של RNA, בריצוף ובטכניקות של בדיקה כימית (chemical probing).
- נדרשת גישה לפלטפורמות ריצוף של קצוות מצומדים (paired-end sequencing) ותשתית אנליטית לניתוח תגובתיות DMS.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים לטיפול בדגימות ולפירוש הנתונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור זני שמרים שונים או רמות שונות של שפע RNA.
- התפוקה מוגבלת על ידי שלבים רגישים לזמן וטיפול בחומרים כימיים רעילים.
