Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto
16 gennaio 2017
Questo manoscritto descrive un approccio per isolare RNP affini selezionati formati in cellule eucariotiche tramite uno specifico arricchimento diretto da oligonucleotidi. Dimostriamo l'applicabilità di questo approccio isolando un RNP affine legato alla regione retrovirale 5' non tradotta che è composta da DHX9/RNA elicasi A.
L'obiettivo generale di questa tecnica di immunoprecipitazione dell'RNA è quello di isolare e caratterizzare selettivamente complessi proteici endogeni di RNA formati in cellule eucariotiche tramite uno specifico arricchimento diretto da oligonucleotidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del controllo post-trascrizionale, come la composizione delle proteine leganti l'RNA che definiscono i cinque UTR principali di un trascritto retrovirale per regolarne l'espressione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente al ricercatore di isolare e caratterizzare selettivamente uno specifico complesso proteico di RNA di interesse, pur mantenendo la possibilità di condurre un'analisi più globale dell'RNP a valle.
Ebbene, le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la comprensione fondamentale delle infezioni virali e di numerose malattie cellulari. E fornisce informazioni significative sui meccanismi del controllo post-trascrizionale dell'espressione genica. Ciò potrebbe significare nuovi bersagli farmacologici praticabili.
Dopo aver coltivato le cellule ed effettuato l'immunoprecipitazione di una proteina marcata con FLAG secondo il protocollo di testo, trasferire 60 microlitri per IP di liquame di perle magnetiche pro-TG in una provetta da microcentrifuga da 1,7 millilitri. Posizionare la provetta su un rack magnetico e rimuovere la soluzione di conservazione pipettandola accuratamente. Quindi rimuovere la provetta dal rack.
Aggiungere 600 microlitri di 1x tampone di lavaggio. E posizionare il tubo su un rotatore a temperatura ambiente per tre minuti, per lavare ed equilibrare le perle. Posizionare il tubo sulla griglia magnetica e rimuovere il tampone di lavaggio.
Quindi aggiungere 10 volumi di fresco tampone di lavaggio 1x. Aggiungere l'anticorpo immunoprecipitante FLAG alle microsfere magnetiche pro-TG equilibrate. E poi ruotare la provetta a temperatura ambiente per almeno 30 minuti, per coniugare l'anticorpo immunoprecipitante.
Posizionare il tubo sul magnete e rimuovere il surnatante. Quindi rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 1x tampone di lavaggio alle perline e ruotare a temperatura ambiente per tre minuti. Ripetere la fase di lavaggio due volte e rimuovere il tampone finale.
Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule mediante aspirazione e utilizzare 1,5 millilitri di PBS ghiacciato per lavare le cellule due volte. Con un raschietto cellulare rimuovere le celle bagnate e aderenti. Pipettare la sospensione cellulare in provette fresche e quindi centrifugare la coltura a 226 volte G a quattro gradi Celsius, per quattro minuti.
Aggiungere 375 microlitri di tampone a basso contenuto di sale ghiacciato al pellet cellulare e incubare il campione su ghiaccio per cinque minuti per consentire il rigonfiamento. È importante prestare attenzione quando si aggiunge e si risospende il pellet di cella nel tampone di lisi a basso contenuto di sale, per garantire la completa immersione e il rigonfiamento senza interruzioni meccaniche premature. Per raccogliere il lisato cellulare citoplasmatico, aggiungere 125 microlitri di tampone di lisi ghiacciato, quindi utilizzare un omogeneizzatore Dounce pre-raffreddato per eseguire dieci colpi.
Omogeneizzare a fondo con una forza sufficiente a consentire la lisi della membrana plasmatica e i contaminanti del lisato citoplasmatico rilasciato. Ma fare attenzione a non estendere eccessivamente l'interruzione meccanica e rischiare contaminazioni nucleari, interruzione del complesso proteico RNA o perdita di spin rilasciato l'omogenato in una microfuga alla massima velocità per un minuto. Quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,7 millilitri che è stato congelato.
Determinare la concentrazione proteica totale. Riserva del 10% per l'analisi del western blot, da utilizzare come controllo dell'input. Per eseguire l'immunoprecipitazione, aggiungere il volume desiderato di lisato cellulare raccolto alle perle coniugate con anticorpi bersaglio.
Utilizzando 1x tampone di lavaggio, portare il volume totale fino a 600 microlitri e ruotare il campione a temperatura ambiente. Dopo 90 minuti di incubazione, posizionare il tubo IP sul supporto magnetico per raccogliere le perle. Quindi raccogli il surnatante e conservalo come flusso.
Quindi, aggiungere 10 volumi di tampone di lavaggio NETN 150 ghiacciato alle perle coniugate con anticorpi legate all'RNP e ruotare il campione a temperatura ambiente per tre minuti. Dopo aver risospeso i complessi RNP immobilizzati in un tampone di legame 1x secondo il protocollo di testo, regolare il volume rimanente in 100 microlitri di tampone di legame 1x ghiacciato. E scaldare il tubo a 70 gradi Celsius per tre minuti.
Per isolare complessi proteici di RNA affini, aggiungere un oligo di DNA di circa 30 nucleotidi, complementare al limite delle tre sequenze prime dell'RNA di interesse. E incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con un leggero dondolio. Aggiungere da cinque a dieci unità di RNasi H alla provetta e incubare il campione a temperatura ambiente per un'ora per scindere l'RNA dall'ibrido RNA DNA.
Quindi trasferire il surnatante contenente i complessi RNP catturati di interesse in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,7 millilitri. Per raccogliere l'RNA immunoprecipitato, risospendere metà del campione totale di complessi di RNA catturati in 750 microlitri di reagente tiocianato di guanidinio acido. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio alla provetta, agitare energicamente per 10 secondi e incubare a temperatura ambiente per tre minuti.
Dopo la centrifugazione, raccogliere la fase acquosa in una provetta nuova e aggiungere un volume uguale di isopropanolo. Mescolare bene e incubare il campione a temperatura ambiente per almeno dieci minuti. Aggiungere un microlitro di glicole blu al campione e conservarlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per una precipitazione o un'elaborazione efficiente in una data futura.
Centrifugare la provetta a 16.000 volte G a quattro gradi Celsius per dieci minuti. Utilizzare una micropipetta P200 per raccogliere e scartare con cura il surnatante in modo da non disturbare il pellet di RNA. Aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75% in ogni tubo.
Agitare e centrifugare le provette per cinque minuti. Raccogliere e scartare con cura il surnatante come appena dimostrato. Asciugare il pellet all'aria per due o tre minuti e utilizzare 100 microlitri di acqua priva di RNasi per rimetterlo in sospensione.
Applicare 100 microlitri del campione di RNA su una colonna di pulizia dell'RNA. Ed elaborarlo secondo il protocollo del produttore. Infine, eluire l'RNA in 30 microlitri di acqua priva di RNasi e conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un massimo di tre mesi.
Per isolare elementi di controllo post-trascrizionale, o complessi ribonucleoproteici PCE, GAG, RNA, RHA formati in cellule proliferanti. L'immunoprecipitazione dell'RNP FLAG-MS2 è stata effettuata in lisati cellulari HECK293 trasfettati. I risultati mostrano un'efficiente precipitazione della proteina FLAG-MS2.
Poiché DHX9/RHA si trova nel complesso RNP e non nel controllo isotopico IgG, né nel controllo negativo. Qui sono mostrati i western blot di complessi di DNA RNA digeriti con RNasi H. La RNasi H ha scisso l'RNA PCE GAG, rilasciando il complesso RNP specificamente legato ai cinque UTR primi.
Gli RNP associati a DHX9/RHA sono stati arricchiti negli eluenti. È importante sottolineare che gli RNP legati a FLAG-MS2 sono rimasti con le perle coniugate con anticorpi. In questo esperimento, l'immunoprecipitazione HO del loop staminale MS2, contenente PCE GAG RNA retrovirale nelle cellule e negli eluenti, è stata convalidata mediante RT-PCR e QRT-PCR.
I risultati hanno confermato un'associazione selezionata tra DHX9/RHA e l'UTR retrovirale a cinque prime, che è stato evidenziato come un RNP unico, importante per il controllo mirato della traduzione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire tutti i passaggi in modo efficiente e con cura, per garantire il mantenimento dei complessi RNP intatti e l'isolamento dello specifico complesso RNP di interesse.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la spettrometria di massa e l'RNA-Seq, per rispondere a ulteriori domande, come l'associazione globale delle proteine con l'RNA bersaglio. E la regione o l'analisi completa di tutti i trascritti coinvolti all'interno di un particolare RNP. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del controllo genico post-trascrizionale per esplorare i distinti complessi proteici dell'RNA che regolano l'espirazione genica virale patogena e il meccanismo generale del controllo dell'espressione genica cellulare.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere complessi RNP cellulari intatti e determinarne la composizione utilizzando l'arricchimento selettivo diretto da oligonucleotidi. Non dimenticare anche che lavorare con virus patogeni e campioni biologici e sostanze chimiche pericolose come acido o fenolo può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura devono essere sempre prese tutte le precauzioni, come ad esempio adeguati dispositivi di protezione individuale.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive una tecnica di immunoprecipitazione dell'RNA per isolare e caratterizzare in modo selettivo complessi endogeni RNA-proteina in cellule eucariotiche. Il metodo si concentra sulla regione non tradotta 5' di tipo retrovirale e ne evidenzia il ruolo della DHX9/elicasi A dell'RNA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- biologia dell'RNA
- controllo post-trascrizionale
- espressione genica virale
Sfondo
- I complessi RNA-proteina svolgono ruoli fondamentali nella regolazione genica.
- La comprensione di questi complessi può fornire informazioni sulle infezioni virali.
- Il controllo post-trascrizionale è essenziale per la regolazione dell'espressione genica.
- L'UTR 5' è significativo nei trascritti retrovirali.
Scopo dello studio
- Isolare complessi specifici di RNA-proteina mediante arricchimento diretto da oligonucleotidi.
- Caratterizzare la composizione delle proteine leganti l'RNA nei trascritti retrovirali.
- Esplorare le implicazioni per le infezioni virali e le malattie cellulari.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di immunoprecipitazione dell'RNA.
- Arricchimento diretto da oligonucleotidi.
- Caratterizzazione delle proteine leganti l'RNA.
- Analisi delle interazioni RNA-proteina.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di RNP omonime legate ai trascritti retrovirali.
- Identificazione di DHX9/elicasa RNA A nei complessi isolati.
- Informazioni sui meccanismi di controllo post-trascrizionale.
- Identificazione potenziale di nuovi bersagli farmacologici per le infezioni virali.
Conclusioni
- La tecnica migliora la comprensione delle interazioni RNA-proteina.
- Fornisce un quadro per lo studio della regolazione post-trascrizionale.
- I risultati potrebbero portare a nuove strategie terapeutiche contro le malattie virali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente l'isolamento selettivo di complessi specifici di RNA-proteina da cellule eucariotiche, supportando la validazione degli bersagli nella regolazione genica post-trascrizionale. Arricchendo i RNP omologhi nella regione 5' UTR dei trascritti retrovirali, fornisce informazioni meccanicistiche sul controllo della traduzione virale e sui percorsi di risposta allo stress cellulare. L'approccio contribuisce a ridurre i rischi delle ipotesi sui bersagli definendo la composizione del RNP rilevante per strategie antivirali e modificatrici della malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche definendo la composizione delle proteine leganti l'RNA a specifici elementi dell'RNA.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la validazione funzionale delle interazioni RNA-proteina in contesti rilevanti per la malattia.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nella selezione del bersaglio collegando complessi RNP al controllo traduttivo di geni virali e della risposta allo stress.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara complessi RNP validati per analisi proteomiche e biochimiche successive.
- Valore operativo: Fornisce risultati riproducibili e quantitativi, adatti alla standardizzazione dei saggi e alla predisposizione per screening.
- Valore della piattaforma: Permette l'isolamento scalabile di complessi cognati per una valutazione affidabile di composti in flussi di lavoro successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la continuità traslazionale collegando l'identificazione delle RNP nella fase di scoperta alla validazione preclinica dei meccanismi di regolazione genica.
- Valore operativo: Facilita decisioni di avanzamento proporzionate al rischio attraverso la riduzione del rischio meccanicistica di bersagli post-trascrizionali.
- Valore predittivo: Si allinea allo sviluppo di biomarcatori identificando componenti delle RNP associate all'espressione genica patogena.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La tecnica si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto guida, in particolare per i meccanismi di espressione genica mediati da RNA.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'isolamento di specifici complessi RNP da lisati cellulari.
- Screening: Permette la preparazione del saggio attraverso l'isolamento standardizzato di complessi RNA-proteina con composizione definita.
- Analisi: Produce dati proteici e dell'RNA che consentono l'analisi comparativa della composizione dei complessi RNP in condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo informazioni meccanicistiche sul controllo dell'espressione genica virale e cellulare.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per lo studio delle interazioni RNA-proteina su multipli bersagli e aree patologiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi regolati dall'RNA.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità nell'isolamento dei RNP tra diversi laboratori e progetti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti consentendo una riduzione precoce dei rischi associati agli obiettivi coinvolti nel controllo post-trascrizionale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata su un'adeguata valutazione del rischio dei programmi antivirali e di risposta allo stress cellulare, sulla base dei dati sulla composizione dei RNP.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia molecolare, immunoprecipitazione e tecniche di manipolazione dell'RNA.
- Presuppone l'accesso a sistemi di perle magnetiche, centrifughe e attrezzature di laboratorio prive di RNasi.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la progettazione degli oligonucleotidi e i protocolli di digestione con RNasi H.
- Comporta considerazioni di adattamento quando applicato a diversi bersagli di RNA o tipi cellulari.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di un'accurata manipolazione al fine di preservare l'integrità dei complessi RNP durante i passaggi di lisi ed eluizione.
