Novel RNA-Proteine leganti isolamento dalla rapida Metodologia
30 settembre 2016
Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare in modo efficiente un RNA specifico insieme alle proteine associate all'RNA in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sul metabolismo e la regolazione dell'RNA, ad esempio quali siano l'insieme distinto di Fau-Bee-PEE legate a un particolare trascritto. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'elevata efficienza di isolamento, che consente l'identificazione successiva di proteine associate a mRNA nobili.
La metodologia rapida utilizza una ceppa di lievito che co-esprime un MRNA marcato con MS2 e una proteina fusa composta da una proteina legante MS2 e una proteina legante streptavidina. Coltivare 500 millilitri di cellule di lievito a 30 gradi Celsius in mezzo selettivo sintetico con destrosio (SD) fino a un OD600 compreso tra 0,8 e 1,0. Quando le cellule sono pronte, centrifugare a 3000 ×g per 4 minuti a temperatura ambiente e scartare il soprannatante.
Lavare le cellule in PBS e centrifugare nuovamente. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in un volume uguale di SD privo di metionina. Incubare per 45-60 minuti a 30 gradi Celsius per indurre l'espressione della proteina di fusione.
Dopo 45-60 minuti, prelevare 10 millilitri delle cellule per l'estrazione di RNA e utilizzare le cellule rimanenti per la purificazione rapida. Per iniziare questa procedura, aggiungere alle cellule 1,35 millilitri di formaldeide al 37%, fino a una concentrazione finale dello 0,1%, al fine di cross-linkare i complessi RNA-proteina. Continuare l'incubazione a 30 gradi Celsius per 10 minuti.
Per arrestare il cross-linking, aggiungere 26,5 millilitri di glicina 2,5 molari, fino a una concentrazione finale di 0,125 molarità, e incubare a 30 gradi Celsius per 3 minuti. Da questo punto in poi, mantenere tutto sul ghiaccio e lavorare rapidamente per minimizzare la degradazione dell'RNA. Centrifugare le cellule a 3000 ×g per 4 minuti a 4 gradi Celsius.
Eliminare il soprannatante, aggiungere 45 millilitri di PBS freddo e centrifugare nuovamente. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in 5 millilitri di tampone di lisi rapida contenente una concentrazione elevata di inibitori della Rnasi. Dividere la sospensione cellulare in aliquote da 500 microlitri in provette microcentrifuga con tappo a vite e aggiungere circa 400 milligrammi di perle di vetro refrigerate a ciascuna aliquota.
Lisare le cellule in un omogeneizzatore a sferette per tre minuti. Posizionare immediatamente il lisato sul ghiaccio. Trasferire il lisato in nuove provette per microcentrifuga.
Tagliare la parte superiore di una siringa da 5 millilitri e posizionarla su un tubo vuoto da 15 millilitri per utilizzarla come adattatore per i tubi con tappo a vite. Usare un ago caldo per praticare un piccolo foro nel fondo di ogni tubo e posizionarli sopra i tubi da 15 millilitri modificati. Centrifugare gli insiemi di tubi a 3000 ×g per un minuto a 4 °C per eluire il lisato nei tubi da 15 millilitri.
Trasferire il flusso passante da ciascun tubo da 15 millilitri a un nuovo tubo da 1,5 millilitri e centrifugare a 10.000 × g per 10 minuti a 4 gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il sopranatante proveniente da tutti i tubi da 1,5 millilitri in un singolo tubo da 15 millilitri. Mettere da parte 1/50 e 1/100 del volume del lisato rispettivamente per l'isolamento di RNA e proteine.
Iniziare la procedura rapida per l'isolamento di complessi RNA-proteina aggiungendo 300 microgrammi di Avidina al lisato cellulare. Incubare per 30 minuti a 4 gradi Celsius sotto rotazione costante. Mentre il lisato cellulare viene incubato con l'Avidina, prelavare le perle di streptavidina, trasferire circa 300 microlitri della sospensione di perle di streptavidina in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri, centrifugare il preparato, quindi rimuovere il sopranatante superiore, ottenendo così 250 microlitri di perle.
Aggiungere 1 millilitro di tampone di lisi rapida alle perle e centrifugare a 660 ×g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e lavare nuovamente con il tampone di lisi rapida. Per bloccare le perle, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di lisi rapida, 0,5 millilitri di BSA e 10 microlitri di TRNA di lievito e incubare per 1 ora a 4 gradi Celsius con rotazione costante.
Lavare le perle due volte con 1 millilitro di tampone di lisi rapida. Aggiungere 250 microlitri delle perle di streptavidina prelavate al lisato contenente avidina e incubare per 1 ora a 4 gradi Celsius con rotazione costante. Questo tempo di incubazione rappresenta un compromesso tra il garantire un tempo di legame sufficiente e il ridurre al minimo le possibilità di degradazione dell'RNA.
Dopo un'ora, centrifugare a 660 ×g per 2 minuti a 4 gradi Celsius per rimuovere i microsfera di streptavidina. Trasferire il soprannatante in un tubo da 15 millilitri. Mettere da parte 1/50 e 1/100 del volume del lisato rispettivamente per l'isolamento di RNA e proteine.
Aggiungere 1 millilitro di tampone di lisi rapida alle perle. Mescolare mediante pipettaggio, trasferire in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 660 ×g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Lavare altre tre volte con il tampone di lisi rapida.
Dopo l'ultimo lavaggio con il tampone di lisi rapida, rimuovere il soprannatante, aggiungere 1 millilitro di tampone di lavaggio rapido e ruotare per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Centrifugare e lavare altre 2 volte con il tampone di lavaggio rapido. Lavare le perle con 1 millilitro di PBS e centrifugare come in precedenza.
Rimuovere il soprannatante, aggiungere alle perle 120 microlitri di PBS e ruotare per 5 minuti su un agitatore rotante. Centrifugare come in precedenza e raccogliere tutto il soprannatante per l'estrazione di RNA e proteine come campione di lavaggio. Per eluire l'RNA e le proteine associate all'RNA, aggiungere alle perle 120 microlitri di biotina 6 millimolare in PBS e incubare per 45 minuti a 4 gradi Celsius con rotazione costante.
Centrifugare le perle e trasferire il materiale eluito in un nuovo tubo da 1,5 millilitro. Centrifugare nuovamente il campione eluito e trasferire la fase superiore in un nuovo tubo da 1,5 millilitro per assicurare l'assenza di trascinamento delle perle. Prelevare campioni per l'estrazione di RNA o proteine.
Per determinare l'efficienza di isolamento e la qualità dell'RNA, è stata eseguita un'analisi Northern per due RNA marcati: PMP1 e FPR1, ottenuti dalla lisi delle cellule in situ, dalla lisi rapida delle cellule e dopo l'eluizione con biotina. Gli RNA ribosomiali sono stati rilevati mediante colorazione con bromuro di etidio, e l'assenza di RNA ribosomiali nel campione eluito indica la stringenza della purificazione.
La stringenza e la specificità della purificazione sono ulteriormente dimostrate dall'assenza di segnale di un MRNA non marcato nei campioni di eluizione. Il segnale apparente nella corsia FPR1, che non ha le dimensioni di ACT1, è un residuo dell'ibridazione precedente con la sonda MS2L. Sebbene l'RNA in ingresso sia in qualche modo più degradato rispetto all'RNA purificato mediante il protocollo Hot Phenol, viene isolata in modo specifico una quantità significativa di RNA marcato a lunghezza intera, come evidenziato dal forte segnale nelle frazioni di eluizione.
I campioni proteici possono essere analizzati mediante elettroforesi SDS-PAGE e colorazione argentica prima dell'analisi proteomica. La proteina di fusione MS2-CP-GFP-SBP, indicata dalla freccia, dimostra un uguale caricamento proteico. Gli asterischi indicano bande con intensità differenziali che sono state successivamente escisse dal gel per l'analisi mediante spettrometria di massa.
Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante indossare guanti, assicurarsi di avere un'area di lavoro pulita, preparare le soluzioni con acqua priva di RNasi ed operare rapidamente ed in modo efficiente per ridurre il tempo del protocollo. Non dimenticare che l'uso di reagenti come il fenolo e il formaldeide può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come lavorare sotto cappa chimica devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come purificare in modo efficiente ed efficace l'RNA di fayn-tress e del suo corpo associato.
Al termine di questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'RNA-Seq, al fine di rilevare gli RNA che si legano al trascritto di interesse.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo in vivo per isolare un RNA specifico insieme alle proteine associate. Questa tecnica mira a migliorare la nostra comprensione della regolazione dell'RNA all'interno delle cellule.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Interazioni RNA-proteina
- Processi cellulari
- Metabolismo dell'RNA
Sfondo
- Le interazioni RNA-proteina sono fondamentali per numerose funzioni cellulari.
- Comprendere queste interazioni può fornire informazioni sul controllo della regolazione dell'RNA.
- I metodi esistenti possono risultare inefficaci nell'isolare complessi specifici di RNA-proteina.
- Questo studio presenta un nuovo approccio che utilizza ceppi di lievito.
Scopo dello studio
- Isolare RNA specifici e identificare le proteine associate in vivo.
- Indagare domande relative al metabolismo e alla regolazione dell'RNA.
- Migliorare l'efficienza delle tecniche di isolamento di complessi RNA-proteina.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un ceppo di lievito che esprime contemporaneamente mRNA marcato con MS2.
- Proteina di fusione del legante MS2 e della proteina legante lo streptavidina.
- Crescita delle cellule di lievito in mezzo sintetico con destrosio.
- Centrifugazione per isolare i complessi RNA-proteina.
Risultati principali
- È stata raggiunta un'alta efficienza nell'isolamento di complessi RNA-proteina.
- È stata facilitata l'identificazione di nuove proteine associate a mRNA.
- Il metodo consente un rapido trattamento dei campioni.
- Sono state ottenute informazioni sui meccanismi di regolazione dell'RNA attraverso questo approccio.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce uno strumento prezioso per lo studio delle interazioni RNA-proteina.
- Migliora la nostra comprensione del metabolismo e della regolazione dell'RNA.
- Applicazioni future potrebbero portare a scoperte nei processi cellulari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Management
L'identificazione delle proteine leganti l'RNA (RBPs) associate a trascritti specifici è fondamentale per la validazione degli obiettivi terapeutici nell'ambito dei farmaci a base di RNA e nella scoperta di biomarcatori. La metodologia RaPID consente l'isolamento efficiente di complessi RNA-proteina in vivo, supportando la riduzione del rischio meccanicistico grazie alla chiarificazione delle interazioni funzionali in un sistema rilevante per la malattia. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta fornendo dati quantitativi e riproducibili sulle associazioni tra RBP e mRNA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche identificando le proteine leganti l'RNA associate a mRNA rilevanti per le malattie, come PMP1 associato al reticolo endoplasmatico.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro riproducibile per l'isolamento di complessi RNA-proteina nativi da lievito, riducendo i falsi positivi derivanti da metodi in vitro.
- Valore predittivo: Supporta la fiducia nel bersaglio grazie al recupero specifico ed efficiente di interazioni in vivo, facilitando la selezione del portafoglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera sistemi biologici validati (ceppi di lievito che esprimono RNA marcato con MS2 e proteina di fusione) per applicazioni di screening successive.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento complesso mediante precipitazione con perle di streptavidina, migliorando la riproducibilità tra esperimenti.
- Prontezza del saggio: Produce frazioni purificate di RNA e proteine adatte ad analisi quantitative mediante spettrometria di massa o Northern blot.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega l'identificazione delle proteine leganti l'RNA nella fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo analisi successive come RNA-Seq ed SDS-PAGE.
- De-risking meccanicistico: Dimostra stringenza e specificità attraverso l'assenza di segnali di RNA ribosomiale e di mRNA non marcati nei campioni eluiti.
- Sistema rilevante per le malattie: Applicabile a modelli di lievito del metabolismo dell'RNA, con potenziale adattamento a sistemi mammiferi per la validazione degli obiettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo RaPID si inserisce nel continuum della scoperta precoce, sostenendo la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico prima dell'identificazione del capostazione e della validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi isolando specifici complessi RNA-proteina da condizioni in vivo, chiarificando le associazioni funzionali.
- Screening: Permette lo sviluppo di saggi attraverso l'isolamento standardizzato di complessi RNA-proteina, supportando screening riproducibili di composti o screening genetici.
- Analisi: Produce risultati quantitativi mediante spettrometria di massa e analisi Northern blot, consentendo il confronto dell'abbondanza di RBP in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Supporta la continuità preclinica fornendo complessi purificati per la validazione successiva in modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la scoperta di RBP su più trascritti, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella regolazione dell'RNA.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità attraverso passaggi definiti di crosslinking, lisi e purificazione basata su microsferette.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione fornendo dati affidabili sulle interazioni RBP-mRNA, riducendo il rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio degli obiettivi in base alle associazioni RBP validate in contesti rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia molecolare, coltura di lieviti e tecniche di interazione RNA-proteina.
- Necessita di strumentazione per il crosslinking (formaldeide), la separazione su microsferette e la centrifugazione a diverse velocità.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla composizione del buffer di lisi e all'uso di inibitori della RNasi, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni di adattamento nel passaggio dal lievito ad altri sistemi modello, in particolare per quanto riguarda l'etichettatura e l'espressione delle proteine di fusione.
- Presenta limitazioni pratiche, come il rischio di degradazione dell'RNA durante le lavorazioni e la necessità di manipolazioni rapide e a freddo per mantenere l'integrità del complesso.
