Metodo per l'isolamento e l'identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

Lo scopo di questo video è dimostrare il metodo per l'isolamento e l'identificazione di componenti a RNA e proteici di complessi ribonucleoproteici da estratti cellulari mediante tecniche di immunoprecipitazione. Salve, mi chiamo Garrett Dom e sono uno studente laureato nel dipartimento di Microbiologia Molecolare e Immunologia presso l'Università del Missouri, dove studio sotto la supervisione del Dott. Eli Sso. Grazie ai progressi nel sequenziamento ad alto rendimento e nell'analisi efficiente di microarray, lo studio globale dell'espressione genica e la sua analisi sono diventati una forma semplice e facilmente accessibile di raccolta dati in molti modelli di ricerca e di malattia.

Tuttavia, lo studio dei livelli di stato stazionario dell'mRNA del gene bersaglio non sempre si correla direttamente con i livelli stazionari delle proteine. Una probabile spiegazione della divergenza tra i due è la regolazione genica post-trascrizionale, guidata dalle interazioni delle proteine leganti l'RNA.

La regolazione post-trascrizionale influisce sul localizzazione, stabilità e traduzione dell'mRNA formando un complesso ribonucleoproteico con gli mRNA bersaglio. Identificare questi sconosciuti bersagli mRNA De novo da estratti cellulari all'interno di questo complesso è fondamentale per comprendere i meccanismi e le funzioni della proteina legante l'RNA e il loro effetto risultante sull'output proteico. Questo protocollo descrive un metodo denominato ribo proteina, immunoprecipitazione immuno o RIP, che permette l'identificazione di specifici mRNA associati al complesso ribonucleoproteico.

Prima di iniziare l'esperimento, è fondamentale disporre di tutti i reagenti, contenitori e utensili. Trattare le attrezzature in vetro libere da RNA con un inibitore di Rnasi, come RNA ZAP di ambion, seguito da risciacquo con acqua trattata al dpci, e assicurarsi che tutti i reagenti siano confermati privi di RNA. Il primo passo della procedura consiste nel raccogliere il complesso ribonucleoproteico dal lisato cellulare: raccogliere cellule tessutali in crescita esponenziale per produrre da due a cinque milligrammi di proteina totale per ogni campione utilizzato; in genere, due piastre da P uno 50 sono sufficienti.

Qui stiamo raccogliendo le linee cellulari di carcinoma mammario umano MB 2 31 e MC sette e stiamo analizzando le interazioni ribonucleo della proteina legante l'RNA. È importante notare che, per ogni proteina legante l'RNA in esame, il numero totale di cellule e le quantità di proteina devono essere ottimizzati per massimizzare le interazioni appropriate tra l'mRNA bersaglio e la proteina legante l'RNA. Raccogliere le cellule in pellet mediante centrifugazione a 1000 giri/min per circa otto-dieci minuti a quattro gradi Celsius, quindi lavare tre volte con PBS freddo. Dopo l'ultimo lavaggio, agitare delicatamente il fondo del tubo e risospendere il pellet cellulare in volumi uguali di buffer di lisi polisomale preparato, contenente inibitori di RNasi e proteasi.

Si consiglia di misurare con precisione il volume esatto del pellet cellulare, pipettare delicatamente la miscela per rompere gli aggregati cellulari e incubare il lisato sul ghiaccio per cinque minuti. Centrifugare a 13.000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti; trasferire immediatamente il soprannatante chiarificato in provette microcentrifuga pre-raffreddate per RNA Free, mantenere sul ghiaccio e conservare a meno 80 gradi Celsius.

Questo lisato può essere conservato fino a sei mesi a meno 80 gradi Celsius. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento poiché possono causare degradazione delle proteine e/o dell'mRNA. È preferibile eseguire l'IP immediatamente.

Eseguire una rapida quantificazione della concentrazione di proteina e del lisato utilizzando il saggio proteico di Bradford standard. Successivamente, dovremo preparare i materiali per l'isolamento della nostra proteina specifica di interesse. Inizialmente prerigenerare la proteina.

Ipernottare perline Sphero in tampone N NT due supplementato con BSA al 5% a quattro gradi Celsius. Utilizzare il tampone NT due in rapporto quattro a uno con le perline PAS. È possibile una conservazione a lungo termine fino a diversi mesi a quattro gradi Celsius.

Quando si integra con il 0,1% di azida di sodio prima dell'uso, rimuovere l'eccesso di tampone NT due in modo che il rapporto finale tra perle e tampone sia uno a uno. Utilizzando provette microcentrifuga da 1,5 millilitri prive di RNA, prelevare 100 microlitri di sospensione SRO e aggiungere 30 microgrammi di anticorpo per ogni singola reazione di immunoprecipitazione. Ad esempio, nel nostro esperimento utilizziamo un anticorpo who are, che è un anticorpo IgG di topo uno.

Pertanto, anche il nostro anticorpo di controllo è un IgG. Successivamente, aggiungere da 100 a 200 microlitri di tampone NT2 alla miscela di anticorpi e microsferette. Inoltre, un anticorpo con isotipo abbinato o siero normale intero della stessa specie deve essere utilizzato in parallelo come controllo anticorpale contro l'RNA di fondo.

Aggiungere l'anticorpo appropriato alla miscela di perle e incubare per tutta la notte in rotazione su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius. Preparare le perle rivestite con anticorpo immediatamente prima dell'uso, lavandole con un millilitro di tampone NT2 freddo di ghiaccio per cinque volte; lavare le perle mediante centrifugazione a 13.000 ×g per uno o due minuti a quattro gradi. Rimuovere con attenzione il sopranatante con una pipetta manuale o un aspiratore.

Questo lavaggio aiuta a rimuovere l'anticorpo non legato e i contaminanti di RNA dalla miscela di anticorpi. Una volta completato l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in 700 microlitri di tampone T due freddo di ghiaccio, seguito dal trattamento con vari inibitori di RNA per proteggere gli mRNA bersaglio, inclusi 10 microlitri di RNAs, 10 microlitri di DTT 100 millimolare e 15 microlitri di EDTA. Portare il volume a 900 microlitri con tampone NT due.

Successivamente, immunoprecipiteremo il complesso bersaglio. Raccomandiamo vivamente di utilizzare un passaggio di pre-pulizia per ridurre il segnale di fondo nell'analisi dell'RNA dopo la procedura di rip. Effettuare la pre-pulizia con 15 microgrammi di controllo di isotipo per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere 50 microlitri di perline PAS previamente gonfiate, non rivestite con anticorpo.

Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius con rotazione e successivamente centrifugare a 10.000 ×g a quattro gradi Celsius. Due pellet. Conservare il soprannatante per ip.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di lisato isolato e chiarificato contenente circa due-cinque milligrammi di proteina alla miscela di anticorpi preparata. Diluire il lisato aiuterà a ridurre il fondo. Avvolgere il tubo con parafilm per garantire una chiusura ermetica e incubare a quattro gradi Celsius per quattro ore in rotazione lenta, quindi centrifugare il pellet successivo a 5.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e conservare il soprannatante per un'eventuale analisi mediante stoccaggio a meno 80 gradi Celsius come descritto in precedenza. Lavare le perle cinque volte con un millilitro di tampone T2 freddo di ghiaccio mediante centrifugazione.

Quindi rimuovere il surnatante con una pipetta manuale o un aspiratore. Possono essere utilizzati metodi più rigorosi per ridurre il fondo, aggiungendo al buffer NT2 desossicolato di sodio, urea o SDS. Mantenere i campioni sul ghiaccio il più possibile e lavorare rapidamente per minimizzare la degradazione dell'mRNA bersaglio.

Infine, utilizzeremo trattamenti con DNA e proteinasi K seguiti da precipitazione dell'RNA per isolare gli RNA dei ribonucleoproteine nucleari dopo aver lavato e risospeso le perle in 100 microlitri di buffer N NT due, integrato con cinque microlitri di DNAsi priva di RNAsi. Mantenere i campioni a 37 gradi Celsius per cinque-dieci minuti. Aggiungere un millilitro di buffer N NT due e centrifugare a 5.000 ×g per cinque minuti.

Scartare il sopranatante e aggiungere al pellet di proteine SROs 100 microlitri di tampone NT2 con 5 microlitri di proteinasi K a 10 milligrammi per millilitro e 1 microlitro di SDS al 10%. Incubare la sospensione di perle per 30 minuti in un bagno d'acqua a 55 gradi Celsius, agitando delicatamente ogni 10 minuti. La proteinasi K favorirà il rilascio dei componenti ribonucleoproteici. Centrifugare per raccogliere le perle.

Centrifugare a 5.000 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente, raccogliere il soprannatante, il cui volume dovrebbe essere di circa 100 microlitri. Successivamente, aggiungere due perle e 200 microlitri di tampone NT2, quindi centrifugare a 5.000 ×g per due minuti. Raccogliere circa 200 microlitri di soprannatante e scartare le perle.

Combinare super natin e aggiungere 300 microlitri di fenolo acido del livello inferiore, quindi vortexare per un minuto a temperatura ambiente. Centrifugare alla velocità massima per un minuto a temperatura ambiente. Raccogliere 250 microlitri del livello superiore.

Si abbia molta cura a non disturbare l'interfaccia, poiché ciò causerebbe contaminazione. Aggiungere al campione di RNA 25 microlitri di acetato di sodio a pH 5,2, 625 microlitri di etanolo al 100% refrigerato e cinque microlitri di glyco blue; mescolare bene e conservare tutta la notte a meno 20 gradi Celsius.

In aggiunta, per garantire un corretto recupero dell'RNA. L'aggiunta di glico blu aumenterà la visibilità del pellet di RNA agendo da molecola vettore il giorno successivo, mescolare i tubi capovolgendoli da tre a cinque volte, quindi centrifugare a 12.000 ×g a quattro gradi Celsius per 30 minuti e scartare il soprannatante. Aggiungere un millilitro di etanolo al 70% freddo al pellet blu e mescolare per inversione o mediante vortex, quindi centrifugare.

Campionare a 12.000 G a quattro gradi Celsius per due minuti. Eliminare il soprannatante e centrifugare a 12.000 G per un minuto a quattro gradi Celsius. Rimuovere con una pipetta qualsiasi residuo di etanolo al 70% e lasciare asciugare all'aria il pellet.

Aggiungere a temperatura ambiente per cinque minuti. Ri-sospendere in 20-40 microlitri di acqua libera da RNA e DNA. Il campione è ora pronto per la quantificazione mediante spettrometria NanoDrop e ulteriori applicazioni a valle, come la PCR quantitativa in tempo reale o l'analisi con microarray, dopo che l'isolamento dell'RNA, il microarray e la PCR quantitativa in tempo reale sono stati eseguiti per rivelare i bersagli mRNA della proteina legante l'RNA who, e il loro conseguente arricchimento ottenuto dall'immunoprecipitazione.

La conferma mediante blotting western rivela un isolamento pulito della proteina d'interesse. La PCR quantitativa dimostra l'arricchimento in termini di copie dell'mRNA bersaglio beta-actina rispetto ai controlli con IgG. Mentre l'analisi con microarray rivela profili genetici unici tra le linee cellulari di carcinoma mammario MC7 e MB231, l'immunoprecipitazione della ribonucleoproteina si è affermata come un eccellente strumento utilizzato dal nostro gruppo, così come da molti altri gruppi di ricerca, per isolare e studiare le interazioni tra le proteine leganti l'RNA e i loro bersagli mRNA. Sebbene questa procedura sia sensibile per natura ed esecuzione, una corretta esecuzione permetterà l'isolamento di questi complessi ribonucleoproteici, che fino a tempi recenti erano inaccessibili per la scoperta e l'analisi.