DNA microarray: Esempio di controllo della qualità, ibridazione e scansione di array

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un esperimento con microarray utilizzando un apparato automatizzato per il mescolamento. Questo viene realizzato analizzando innanzitutto la qualità dei campioni di RNA mediante il bioanalizzatore, successivamente all'amplificazione e all'etichettatura dell'RNA. I campioni di RNA vengono ibridati ai microarray.

Infine, le microarray ibridate vengono lavate e scansionate. In ultima analisi, i risultati ottenuti mostrano l'espressione differenziale dei trascritti di RNA attraverso l'analisi di immagini di microarray a fluorescenza bicolore. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di ibridazione delle microarray sono difficili da apprendere a causa dell'uso di attrezzature specializzate.

L'analisi del controllo qualità inizia con la preparazione dello strumento bioanalyzer 2,100 e della stazione di condizionamento della chip, come indicato nella procedura scritta. La matrice gel viene quindi filtrata prelevando 550 microlitri con una pipetta e trasferendoli in un filtro centrifugo fornito nel kit RNA 6,000 nano. La centrifugazione avviene a 1.500 RCF per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi aliquotare il gel filtrato in aliquote da 65 microlitri, che possono essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Vortexare il concentrato di colorante per 10 secondi e aggiungere un microlitro a un'aliquote da 65 microlitri. Dopo aver vortexato la miscela, centrifugare il gel filtrato a 13.000 RCF per 10 minuti a temperatura ambiente per eseguire i campioni.

Posizionare innanzitutto un chip sulla stazione di primerizzazione. In questa dimostrazione, vengono utilizzati chip RNA 6,000 nano. Caricare nove microlitri della miscela di gel colorante nel pozzetto contrassegnato con una G bianca su sfondo nero.

Con la punta della pipetta posizionata nella parte più bassa della pozzetta. Posizionare lo stantuffo della siringa a un millilitro e chiudere la stazione di preriscaldo. Premere lo stantuffo lentamente ma con costanza finché non viene trattenuto dalla clip.

Dopo 30 secondi, rilasciare la clip e lasciare risalire lo stantuffo per alcuni secondi. Quando lo stantuffo si ferma, riportarlo indietro alla posizione di un millilitro e aprire la stazione di preriscaldamento. Caricare nove microlitri del colorante per gel.

Mescolare ciascuno dei due pozzetti. Quindi aggiungere cinque microlitri del marcatore nel pozzetto della scala molecolare e in ciascuno dei 12 pozzetti del campione. Successivamente, caricare un microlitro della scala denaturata nel pozzetto della scala molecolare e un microlitro di ciascun campione denaturato nei pozzetti del campione.

Infine, aggiungere un microlitro del marcatore in ogni campione non utilizzato. Una volta caricato il pozzetto, vortexare il chip per un minuto a 2.400 giri al minuto. Dopo aver avviato il software 2.100 expert, posizionare il chip e chiudere il coperchio.

Assicurarsi che sia selezionata la porta corretta ed eseguire il saggio entro cinque minuti dal caricamento dei campioni per prevenire l'evaporazione. I metodi per l'amplificazione e l'etichettatura dell'RNA sono disponibili nel protocollo scritto. Una volta etichettato, purificare il cRNA per rimuovere eventuali nucleotidi non incorporati; utilizzando colonnine mini di Cogens, il cRNA etichettato può quindi essere quantificato con uno spettrofotometro NanoDrop 2000.

In modalità di misurazione con microarray, registrare concentrazione del campione, resa e attività specifica. Per l'ibridazione con microarray, è necessario ottenere una resa di almeno 825 nanogrammi e un'attività specifica di almeno otto picomoli per microgrammo almeno due ore prima dell'ibridazione con microarray. Accendere la stazione di ibridazione e impostarla a 65 gradi Celsius.

Questo protocollo descrive l'utilizzo di array Agilent quattro per 40 4K con il sistema di ibridazione Roche nimble gen e quattro camere di miscelazione successive alla frammentazione del CRNA eseguita come descritto nel protocollo scritto, preparare la camera di ibridazione. Posizionare un vetrino con microarray nello strumento di montaggio e smontaggio, lato codice a barre. Aprire innanzitutto un miscelatore A4 ed esporre l'adesivo che fissa l'array e lo strumento di montaggio e smontaggio per impedire qualsiasi movimento.

Posizionare il miscelatore A four sulla diapositiva partendo dall'estremità opposta. Assicurarsi che sia correttamente allineato allo strumento e fissare il miscelatore lungo l'array. Scorrere dall'estremità del miscelatore per rimuovere l'insieme diapositiva-miscelatore.

Utilizzando lo strumento di pressatura, premere lungo tutta la guarnizione adesiva per assicurarsi che sia ben incollata al vetrino. Le piccole bolle d'aria intrappolate tra l'adesivo e il vetrino possono essere visibili contro lo sfondo scuro. Dedicate un tempo aggiuntivo per rimuovere queste bolle con lo strumento di pressatura.

L'array è ora pronto per essere caricato. Utilizzare una pipetta a spostamento positivo per caricare 100 microlitri del campione di ibridazione. Inserire con forza la punta all'interno del portello e dispensare lentamente e in modo uniforme, in modo che l'aria non rimanga intrappolata nell'area dell'array.

Quando il campione ricopre l'intero array ed il liquido inizia a fuoriuscire rapidamente dal porto di sfiato, rimuovere la pipetta rilasciando esclusivamente il pistone. Una volta che la punta è lontana dal vetrino, tamponare delicatamente l'eccesso di liquido presso entrambi i porti, avendo cura di non aspirare il campione dalla camera stessa. Quindi coprire i fori con adesivi utilizzando pinzette.

Posizionare il vetrino sulla stazione di ibridazione e verificare che i fori delle membrane siano correttamente allineati sopra gli anelli O. Questo garantisce un'adeguata miscelazione durante l'ibridazione. Chiudere il coperchio del vetrino e il coperchio della stazione.

Impostare la stazione sulla modalità di miscelazione B e ibridare l'array a 65 gradi Celsius per 17 ore. Una volta terminato, riempire una capsula di vetro etichettata A con il buffer di lavaggio uno; la capsula deve essere abbastanza grande da contenere lo strumento di montaggio e smontaggio e consentire anche un certo movimento. Tutti i lavaggi devono essere eseguiti in vetro perché la plastica tende a rilasciare composti, causando un fondo elevato nell'array.

Posizionare un portaoggetti e una bacchetta magnetica in una vaschetta di colorazione. Etichettata con B, riempire la vaschetta con tampone di lavaggio in quantità sufficiente a coprire il portaoggetti e posizionare la vaschetta su un agitatore magnetico a temperatura ambiente. Inoltre, aggiungere una bacchetta magnetica in una vaschetta di colorazione vuota etichettata con C e posizionarla su un agitatore magnetico.

Rimuovere l'array dalla stazione di ibridazione e posizionarlo nello strumento per il montaggio e smontaggio. Immergere l'intero assieme nel piatto, tenendo lo strumento per il montaggio e smontaggio e il vetrino da lati opposti con una mano. Staccare con cura il miscelatore A four, avendo cura di non graffiare l'area dell'array.

Posizionare rapidamente il vetrino sul supporto e nel contenitore di colorazione B. L'esposizione all'aria deve essere ridotta al minimo poiché il colorante SCI five è sensibile all'ozono. Lavare l'erase per un minuto mescolando a velocità media. Riempire il contenitore di colorazione C con il tampone di lavaggio due preriscaldato.

Trasferire i vetrini e lavarli per un minuto. Dopo il lavaggio, rimuovere molto lentamente il portavetrini dalla vaschetta di colorazione C per minimizzare le gocce lasciate sui vetrini. Asciugare il vetrino centrifugandolo per due minuti.

Quindi posizionare il vetrino in un tubo conico da 50 millilitri e riempire immediatamente con gas argon, eseguendo una scansione con il lettore GenePix 4.000 B di Molecular Devices per evitare la perdita di segnale mostrata. Di seguito sono riportati esempi di quattro campioni di RNA isolati dal cervello umano. La qualità del campione di tessuto tumorale è stata valutata utilizzando il Bioanalyzer 2.100 con un chip RNA 6.000.

Le frecce piene e quelle aperte indicano rispettivamente la posizione delle specie di RNA 18 S e 28 S. Il numero di integrità dell'RNA (RIN) è una misura quantitativa della qualità dell'RNA; campioni di RNA totale di buona qualità dovrebbero produrre soltanto due picchi principali quando analizzati con un bioanalizzatore per il controllo di qualità, corrispondenti alle due principali specie di RNA ribosomiale.

Alcune degradazioni dell'RNA si presenteranno come una striscia diffusa prima del primo picco di RNA ribosomiale e un picco significativamente ridotto per il 28 S-R-R-N-A fortemente degradato. L'RNA di bassa qualità mostrerà un picco ampio o una serie di picchi a bassi tempi di ritenzione. Mentre i due picchi di RNA ribosomiale avranno un'intensità molto bassa o non saranno affatto identificabili.

Array di buona qualità dovrebbero produrre un segnale elevato a valori relativamente bassi di PMT. Ci si aspetta che la maggior parte dei trascritti sia presente a livelli simili nel campione sperimentale e in quello di riferimento. Cambiamenti massicci e diffusi nell'espressione genica probabilmente mancheranno di significato biologico.

Pertanto, la maggior parte dell'array dovrebbe apparire gialla piuttosto che verde o rossa. I segnali di buona qualità dovrebbero inoltre trovarsi in un intervallo dinamico tale per cui gli istogrammi dei segnali si sovrappongano completamente, come osservabile nel diagramma a dispersione dell'immagine dell'array. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di microarray utilizzando un apparato automatizzato per l'ibridazione.