Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare sinaptosomi neurozonali attivi nella traduzione dal cortex cerebrale di topo, utilizzando un gradiente di densità discontinuo di saccarosio percoll. Questo viene ottenuto raccogliendo ed omogeneizzando inizialmente i cortex di topo, quindi centrifugando l'omogenato. Successivamente, applicare l'omogenato centrifugato, o il sopranatante, ai gradienti preformati di saccarosio percoll.

L'ultimo passaggio consiste nella centrifugazione e nella raccolta della frazione di sinaptosomi. In definitiva, l'analisi mediante western blot e gli esperimenti di incorporazione di metionina S 35 dimostrano che la frazione di sinaptosomi è arricchita a livello sinaptico e attiva dal punto di vista traduttivo. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la centrifugazione e la filtrazione, sono due: primo, si evita il danno meccanico sfruttando gradienti di densità; secondo, il metodo presenta una bassa tossicità per le cellule e i loro costituenti.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà con questo protocollo perché i tempi rivestono un ruolo fondamentale. Una volta che i cortici sono stati raccolti, la procedura deve essere completata rapidamente. Per iniziare la procedura, preparare i livelli di gradiente al 3, 10, 15 e 23% aggiungendo le rispettive quantità di SIP, come descritto nel manoscritto allegato, al tampone GM e mescolare bene.

Versare i livelli a gradiente pipettando due millilitri da ciascuna delle 23 soluzioni isosmotiche di percol al 15, 10 e 3% nei tubi da centrifuga Beckman con tappo. Utilizzando una pipetta P1000, l'interfaccia tra i livelli deve essere chiaramente distinguibile, senza mescolamento dei livelli. Conservare i gradienti a quattro gradi Celsius per almeno 20 minuti prima dell'uso.

Prima di iniziare questa procedura, preparare le altre soluzioni necessarie come descritto nel manoscritto allegato. Eutanasia del topo all'età di P 13 a P 21 e preparazione per la dissezione spruzzando il collo e la testa con etanolo al 70%. Quindi utilizzare un paio di forbici affilate per recidere il midollo spinale alla base del cranio.

Successivamente, rimuovere la pelle dalla parte superiore del cranio. Tagliare il cranio lateralmente tra l'osso parietale e l'osso interparietale, oppure tra le regioni del cervello e della corteccia. Dopodiché, tagliare il cranio dalla base fino al naso lungo la sutura sagittale.

In questa fase, rimuovere con attenzione l'osso parietale molle tirando ciascun emisfero lateralmente. Successivamente, inserire la spatola nel cervello sopra il cervelletto per prelevare la corteccia. Posizionarla in tampone GM freddo su ghiaccio e ripetere nuovamente le procedure per raccogliere ulteriori cortecce.

Ora risciacquare le cortecce in tampone GM freddo con ghiaccio. Successivamente, trasferire due cortecce in un omogeneizzatore in vetro contenente cinque millilitri di tampone GM freddo. Omogeneizzare delicatamente le cortecce con cinque-dieci movimenti del pestello A, il pestello largo, seguiti da cinque-dieci movimenti del pestello B, il pestello stretto.

Il numero di passate varia a seconda dell'omogeneizzatore individuale. Trasferire l'omogenato in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare a 1000 ×g.

Centrifugare per 10 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga Allegra six KR per ottenere un pellet di detriti cellulari e nuclei. Sovraporre due millilitri del sopranatante per ciascun gradiente di saccarosio, preparando un gradiente per ciascuna corteccia intera, quindi chiudere le provette. Successivamente, centrifugare in un rotore ad angolo fisso a 32.500 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga Beckman J 2 21.

Una volta completato, utilizzando adattatori appropriati, il gradiente dovrebbe presentare una marcata banda SN; prelevare con una pipetta e scartare la soluzione sopra la banda SN. Con una pipetta di vetro a pasta, prelevare la banda SN all'interfaccia tra il 15 e il 23%; in genere, un singolo gradiente fornisce circa 0,9-1,1 millilitri di sns. Successivamente, trasferirla in un tubo conico e conservarla sul ghiaccio.

Quindi, regolare la concentrazione di sale del SNS aggiungendo un decimo del volume di buffer di stimolazione 10 volte concentrato. Opzionalmente, aggiungere cloruro di calcio 1000 volte concentrato per ottenere una concentrazione finale di 12 ano molar. Successivamente, aggiungere il stock di TTX a un millimolare per ottenere una concentrazione finale di un micromolare, al fine di sopprimere l'eccitazione non specifica.

Il passaggio successivo consiste nell'utilizzare il SNS nell'applicazione a valle pertinente, come ad esempio negli studi sulla traduzione proteica. Per altre applicazioni, il lisato di SN può essere purificato o concentrato utilizzando il kit di preparazione campioni Pierce SDS page. La concentrazione proteica del SNS può essere determinata utilizzando il kit per il saggio proteico micro BCA.

Di seguito è riportato un esempio di sei bande o frazioni. Quando la corteccia di topo è stata omogeneizzata e separata su gradienti discontinui di saccarosio al perolo, le SNS arricchite erano contenute nella banda cinque all'interfaccia tra il 23% e il 15%; questa banda è stata rimossa ed esaminata mediante microscopia elettronica. Un esempio di vescicole sinaptiche integre e della conservazione degli elementi pre-sinaptici e post-sinaptici è mostrato qui nel blotting occidentale.

Un aumento dei marcatori sinaptici e una diminuzione delle impurità nella banda SN da un gradiente discontinuo al saccarosio dimostrano che l'aumento dell'incorporazione di metionina S 35 in seguito all'aggiunta di glutammato è dovuto a una sintesi proteica de novo. È stato aggiunto anesa micina a 40 micromolar, un inibitore della sintesi proteica. Questa figura mostra la marcata riduzione dell'incorporazione di metionina S 35 in presenza di anso micina, con o senza glutammato, rispetto ai livelli basali.

Pertanto, i gradienti discontinui di saccarosio peral producono rapidamente SNS altamente attivi e relativamente puri, che possono essere utilizzati per lo studio della traduzione proteica. Questa figura mostra che la banda cinque del gradiente discontinuo di saccarosio per core contiene i livelli più elevati di sintesi proteica *de novo*. Gli SNS preparati facendo passare l'omogenato corticale attraverso una serie di filtri con dimensioni di poro decrescenti e successivamente centrifugando su un gradiente discontinuo di saccarosio per core, utilizzati a scopo comparativo, contengono un numero maggiore di membrane rotte e una quantità minore di SNS interi rispetto agli SNS preparati con il metodo del gradiente discontinuo di saccarosio perol. Gli SNS preparati mediante il metodo del gradiente discontinuo di saccarosio peral mostrano un'attività di sintesi proteica *de novo* maggiore rispetto agli SNS preparati utilizzando il metodo di filtrazione.

Si è dimostrato che le SNS preparate da topi più giovani presentano un'attività traduttiva maggiore rispetto a quelle di topi più anziani. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara idea di come isolare le zone neurosinaptiche con attività traduttiva attiva, omogeneizzando le cortecce di topo, centrifugando l'omogenato in un rotore a cestelli oscillanti, centrifugando successivamente il soprannatante su un gradiente di saccarosio percall in un rotore ad angolo fisso e raccogliendo infine la banda delle zone neurosinaptiche risultante.