FSL Costruisce: un metodo semplice per la modifica di Cell / Virion Superfici con una gamma di marcatori biologici senza compromettere la loro vitalità

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare in modo innocuo e rapido le superfici di cellule vive o di S con costrutti bioattivi. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto una soluzione di costrutti costituiti da uno spacer funzionale, un lipide o un FSL. Successivamente, una parte uguale della soluzione di costrutti viene mescolata con una parte uguale della soluzione di cellule o di VIRs.

Come terzo passaggio, la miscela viene incubata per 60 minuti a 37 gradi Celsius. L'ultimo passaggio consiste nel lavare le cellule o citi modificati o VIR modificati o VIR e nell'utilizzarli sperimentalmente come di consueto. In definitiva, le cellule vive o S con superficie modificata possono essere visualizzate mediante tutte le comuni tecniche di analisi sperimentale, inclusi citometria a flusso, microscopia e agglutinazione.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'etichettatura covalente, è che è rapida, robusta, flessibile e non influisce sulla vitalità della cellula modificata o di Varian. Per preparare la soluzione madre del costrutto FSL, aggiungere innanzitutto un millilitro di diluente al flaconcino del prodotto per ricostituire il prodotto FSL liofilizzato, ottenendo una soluzione madre da un milligrammo per millilitro. Sottoporre il flaconcino a sonificazione per 30 secondi, suddividere la soluzione madre in aliquote da 100 microlitri in contenitori sterili e conservare i contenitori a due-otto gradi Celsius per un massimo di una settimana.

Per preparare soluzioni operative di costrutti FSL da inserire immediatamente prima dell'uso, sottoporre nuovamente la soluzione a sonificazione per 30 secondi per omogeneizzare eventuali aggregati cellulari, quindi diluire il costrutto FSL e il tampone alla concentrazione richiesta. Conservare la soluzione operativa a due-cinque gradi Celsius per un massimo di una settimana dopo la risospensione in un mezzo privo di lipidi o in PBS. Centrifugare le cellule per rimuovere i lipidi non legati prima della modifica con FSL. Successivamente, risospendere le cellule in 100 microlitri di diluente e lavare le cellule destinate ai controlli nelle stesse condizioni, portandole a un volume di 100 microlitri di cellule non modificate.

Aggiungere 100 microlitri di un'opportuna diluizione della soluzione FSL, se desiderato. In parallelo, creare anche controlli negativi con soluzioni FSL non correlate e/o PBS. Quindi incubare tutti i sottoinsiemi cellulari per un'ora a 37 gradi Celsius dopo l'incubazione.

Lavare tutte le cellule due volte con mezzo privo di lipidi o con PBS per rimuovere eventuali costrutti FSL liberi e preparare un’adeguata sospensione in mezzo privo di lipidi. Una volta completato il processo di modifica con FSL, i costrutti possono essere conservati tra i quattro e gli otto gradi Celsius come un fiore. I costrutti FSL sono costituiti da tre componenti principali: la testa funzionale o F, che può essere costituita da una varietà di gruppi funzionali biologici.

Lo spaziatore RS è progettato per indurre un allontanamento della testa funzionale dalla membrana, al fine di migliorare la dispersione in acqua, e per essere non reattivo con il siero umano e con il lipide DAL o L, consentendo così al costrutto di incorporarsi spontaneamente nelle superfici quattro. Gruppi FSL rappresentativi sono mostrati nelle seguenti cinque immagini. Embryoni murini vivi sono stati etichettati direttamente con FSL fluoresceina mediante il metodo di due ore a 37 gradi Celsius in mezzo di coltura cellulare privo di siero, lavati e quindi osservati mediante microscopia a fluorescenza.

In questa prima immagine, è possibile osservare un embrione speculare a due cellule privo di zop palita. La colorazione intensa al centro dell'embrione è rappresentativa di una tipica colorazione del corpuscolo polare. Nelle due immagini successive, sono mostrati embrioni speculari a quattro e otto cellule privi di zop palita, che presentano una colorazione sfumata delle cellule situate al di fuori del piano di fuoco del microscopio.

Un'immagine di un embrione speculare libero di zop palita a 16 cellule è mostrata in quest'ultima immagine di embrioni speculari vitali etichettati con fluoresceina FSL; embrioni blastocistici speculari integri di quattro-cinque giorni, con sia l'embrione che lo zop LUCITA etichettati, sono mostrati in questa serie successiva di immagini. È mostrata l'etichettatura con fluoresceina FSL del pesce zebra. Questa prima immagine rappresenta una microangiografia di una larva di pesce zebra a 52 ore post-fecondazione a cui è stata iniettata direttamente in circolo la fluoresceina FSL.

Qui si può osservare la colorazione della vascolarizzazione del pesce zebra. I citi renali eterogenei del pesce zebra o ZK citi, creati ex vivo, sono stati microiniettati nella circolazione di un pesce zebra ricevente a 52 ore post-fecondazione; osservazioni in vivo dei ZK citi sono state effettuate due ore dopo l'iniezione, mediante imaging della vascolarizzazione in fluorescenza con microscopia a tempo-lampo. Viene mostrato un singolo fotogramma video con cellule di grandi dimensioni, lente o immobili, indicate da frecce arancioni, e cellule veloci, che appaiono sfocate a causa del loro movimento, indicate da frecce verdi. In questa immagine, la marcatura con FSL fluoresceina ottenuta per assunzione orale del costrutto, raggiunta immergendo embrioni di pesce zebra in un mezzo contenente FSL fluoresceina per un periodo fino a cinque giorni, è mostrata.

La microscopia in campo chiaro del pesce zebra trattato con fluoresceina FSL a sinistra corrisponde all'immagine fluorescente adiacente a destra. La fluorescenza era localizzata preferenzialmente nel tratto intestinale. Nessuna colorazione è stata osservata negli embrioni di controllo non trattati mostrati qui.

Qui il virus della stomatite vescicolare o VSV, direttamente marcato con 10 microgrammi per millilitro di FSL fluoresceina per due ore a 37 gradi Celsius, seguito da fissazione con paraformaldeide al 4% e successivamente analizzato mediante scansione FACS, è mostrato senza purificazione del virione VSV. È stato richiesto un ulteriore marcatore FSL. Questo istogramma mostra cellule testicolari suine infettate con il virus umano A Puerto Rico 8 19 34 o H1N1 marcato con FSL fluoresceina.

Le cellule non infette non fluorescenti sono rappresentate dalla linea nera, mentre la fusione del coronavirus H1N1 con le cellule suine, che ha prodotto fluorescenza, è indicata dalla linea rossa. Nella seguente serie di immagini, le cellule sono state inizialmente marcate con biotina FSL per un'ora a 37 gradi Celsius, quindi lavate e fatte reagire con avidina marcate con Fluor 4, successivamente lavate e montate in vetrina umida per la microscopia a fluorescenza. La prima immagine mostra un'immagine confocale ricostruita di blastocisti di embrione murino, mentre questa figura mostra una sezione confocale centrale dell'embrione proveniente dall'immagine precedente.

Ecco degli spermatozoi umani mobili in vita. L'effetto di sfocatura è dovuto al loro movimento. Un'immagine rappresentativa più nitida di spermatozoi umani fissati con paraformaldeide al 4% dopo l'inserimento è visibile in questa figura qui.

Nei globuli rossi umani marcati con biotina FSL, la fissazione con paraformaldeide al 4% prima dell'inserimento non influenza l'etichettatura FSL, come illustrato nelle due figure seguenti. Qui si possono osservare cellule di carcinoma endometriale umano RL 95 fissate con paraformaldeide al 4%. Mentre in questa immagine, le cellule di carcinoma endometriale umano RL 95 non sono state fissate. Non si osservano praticamente differenze nell'etichettatura tra le due immagini, con o senza fissazione.

Qui a sinistra sono mostrati globuli rossi marcati con biotina FSL osservati in un campione di sangue prelevato due ore dopo l'infusione endovenosa dei citi; a destra, le cellule sono state osservate mediante microscopia ottica. Lo stesso campo di cellule è stato osservato in fluorescenza e i due citi presenti possono essere identificati in verde. Il calcolo del rapporto tra i citi e le cellule non marcate può essere utilizzato come indicatore della sopravvivenza. Quest'ultima immagine di citi umani endometriali vivi marcati con biotina mostra le cellule visualizzate grazie al legame con perle abbattute.

Questa serie finale di immagini mostra le interazioni del costrutto FSL con i marcatori dei gruppi sanguigni. La prima immagine mostra eritrociti umani GLI rivestiti con una concentrazione di 500 microgrammi per millilitro di FSLG, testati contro diluizioni di siero umano. Gli eritrociti umani non reagiscono naturalmente con l'antigene Xena né con l'antigene GALI.

Pertanto, le citocellule possono essere utilizzate per quantificare i livelli di anticorpi nel siero. In questo esempio, si è determinato che il paziente presentava un titolo di anticorpi di uno a 32, creando citocellule con livelli decrescenti di FSL. In modo analogo alla determinazione del titolo di un antigene, è possibile stabilire il livello ottimale di antigene per rilevare l'anticorpo; si possono quindi creare cellule che diano un risultato positivo solo quando il livello di anticorpo supera un determinato titolo.

Il livello di antigene FSL necessario per ottenere un risultato positivo dipende dalla qualità e dalla concentrazione dell'anticorpo che si intende rilevare. Tipicamente, per antigeni di tipo carboidrato, una soluzione FSL di 100 microgrammi per millilitro determina una reazione positiva intensa. I globuli rossi di gruppo O umano modificati per presentare un livello specifico di antigene a sono definiti standardizzati.

I citi vengono utilizzati per quantificare in modo accurato e riproducibile gli anticorpi nel siero umano. In questo esempio, i citi sono stati preparati a partire dai globuli rossi dello stesso donatore e il livello di anticorpi nel siero di gruppo O testato si è rivelato compreso tra uno e 32. Nella sesta provetta mostrata, antigeni del gruppo sanguigno A e B sono stati inseriti contemporaneamente in un singolo campione di globuli rossi di gruppo O per creare citi con debole reattività A e debole reattività B.

Queste emazie possono essere utilizzate per finalità di controllo qualità VO. L'analisi delle emazie formulate specificamente per la settimana A e per la settimana B, testate con reagenti anti A e anti B, fornisce le reazioni deboli previste, come evidenziato in questa figura dalle reazioni che si verificano nella zona centrale inferiore dei tubi. Questa semplice tecnica può essere eseguita in due ore se effettuata correttamente.