RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans

Lo scopo di questa procedura è identificare i regolatori post-embrionali dell'espressione e della localizzazione proteica in C. elegans, utilizzando uno schermo genomico basato su RNAi e proteine marcate con fluorescenza. Una volta costruito il ceppo appropriato per lo screening, si sceglie una libreria di RNAi. Il primo passaggio della procedura consiste nell'inserire i cloni della libreria all'interno di batteri.

I batteri vengono quindi selezionati, coltivati e somministrati a nematodi C. elegans in stadi controllati. Dopo aver lasciato sviluppare i nematodi per 72 ore, si osservano eventuali alterazioni nel fenotipo di interesse. Infine, si visualizzano variazioni nell'espressione o nella localizzazione subcellulare della proteina bersaglio mediante microscopia a fluorescenza.

Questo metodo può identificare i geni necessari per la corretta localizzazione subcellulare di una proteina marcata con un fluorocromo. Tuttavia, questo protocollo può essere modificato per identificare geni che influenzano altri fenotipi post-embrionali di interesse. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai protocolli pubblicati esistenti è che abbiamo ottimizzato la costanza e il livello della risposta a interferenza dell'RNA (RNAi) negli animali inducendo la produzione di RNA a doppio filamento nei batteri prima della semina.

La procedura sarà dimostrata da Kathy Fuss, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Entro due mesi dall'inizio dell'esperimento, preparare la libreria di cloni seminando batteri provenienti da cloni selezionati della libreria di alimentazione, nonché controlli positivi e negativi, su piastre LB contenenti tetraciclina. Come controllo positivo, utilizzare un clone contenente un gene che produce un fenotipo post-embrionale dipendente dalla dose, come BLE4. Come controllo negativo, utilizzare un vettore vuoto o un clone contenente un pseudogene predetto privo di fenotipi osservati.

Incubare le piastre durante la notte: per ogni clone, inoculare due millilitri di mezzo LB contenente 50 microgrammi per millilitro di acido carbonico con una singola colonia proveniente dalle piastre di striatura. Incubare le colture durante la notte con agitazione. La mattina successiva, le soluzioni dovrebbero essere torbide; indurre la produzione di RNA a doppio filamento aggiungendo IPTG alle colture e incubarle per ulteriori quattro-cinque ore nelle stesse condizioni.

L'aggiunta di IPTG garantisce un'inibizione indotta da RNAi del prodotto genico più consistente e robusta rispetto al solo affidamento all'IPTG e all'auger della piastra NGM. Dopo l'incubazione con IPTG, depositare 30 microlitri di coltura da ciascun clone in ciascun pozzetto delle piastre NGM RNAi preparate da 24 pozzetti. Un clone per pozzetto. Ogni piastra deve avere due pozzetti dedicati ai controlli.

Segnare con attenzione la posizione di ciascuna libreria. Dopo aver clonato nelle piastre a 24 pozzetti, posizionare le piastre scoperte in una cappa a flusso laminare sterile per farle asciugare per circa 20 minuti. Non permettere che i bordi dell'agar si stacchino dalla piastra.

Dopo aver essiccato i nematodi stadiati sulle piastre, vengono fornite le istruzioni per la preparazione dei nematodi. Nella sezione successiva, iniziare con una popolazione stadiata di nematodi al primo stadio larvale o L1. Partire da larve L1 consente di evitare potenziali fenotipi letali embrionali.

Avere una popolazione di animali stadiata da sottoporre a screening aumenta anche la sicurezza che eventuali variazioni osservate siano dovute all'RNAi e non semplici variazioni normali che si verificano in stadi diversi. Tuttavia, se l'RNAi causa un ritardo nello sviluppo, questo dovrebbe essere annotato da chi effettua lo screening Bleach. Una popolazione di stadi misti della ceppia da sottoporre a screening.

Sopravvivranno solo gli embrioni protetti dal guscio; questa fase consente di stadiare gli animali entro 12 ore se condotta a 20 gradi Celsius o entro 18 ore se condotta a 16 gradi Celsius nel giorno in cui vengono inoculate le colture batteriche. Selezionare tre piastre da 100 millimetri contenenti animali della ceppia di screening sani e che presentino sia adulti che embrioni.

Lavare tutti gli animali in mezzo sterile M nine e trasferire il lavaggio in un tubo sterile da 15 millilitri con tappo a vite. Se il lavaggio supera i 3,5 millilitri, centrifugare gli animali e rimuovere il liquido fino a lasciarne solo 3,5 millilitri. Se inferiore a 3,5 millilitri.

Aumentare il volume fino a 3,5 millilitri con acqua o M nine per liberare gli embrioni dagli adulti, utilizzando 1,5 millilitri di una miscela di idrossido di sodio e candeggina per ogni lavaggio. Lasciare incubare gli animali nella soluzione per non più di 10 minuti. Dopo aver avviato un timer, vortexare ogni provetta per 10 secondi e ripetere il vortex ogni due minuti.

Dopo ogni vortex, osservare la soluzione al microscopio stereoscopico alla ricerca di carcasse animali. Entro sei-otto minuti, gli adulti saranno frammentati e dovrebbero essere rilasciati gli embrioni. Rimuovere gli embrioni dalla soluzione di ipoclorito centrifugandoli e asportando la maggior quantità possibile del soprannatante senza disturbare il pellet.

Quindi risospendere il pellet in un volume di 10 millilitri aggiungendo M nove sterile ed eseguendo un'agitazione. Ripetere questo processo di lavaggio almeno un'altra volta fino a quando l'odore della candeggina non risulti completamente impercettibile. Per ottenere un arresto più preciso degli animali alla loro fase L uno, far schiudere gli embrioni in mezzo M nove senza cibo.

Questo viene fatto trasferendo gli embrioni in M nine in un piccolo matraccio erlenmeyer. Agitare il matraccio tutta la notte alla temperatura appropriata per la ceppa e l'esperimento. Durante questo periodo, tutti gli animali schiuderanno e andranno in arresto nella diapausa L uno il giorno successivo.

Riprendere la crescita delle larve a partire da un determinato punto temporale trasferendole sui batteri preparati che esprimono RNA a doppio filamento. Questo avviene nello stesso giorno in cui le piastre a 24 pozzetti sono state inoculate con i batteri. Iniziare trasferendo gli animali L1 in una provetta da 15 millilitri e centrifugandoli. Successivamente, concentrare gli animali in mezzo millilitro fino a un millilitro di M9 e depositare cinque microlitri di nematodi concentrati su una piastra.

Contare il numero di animali sulla piastra e regolare la soluzione concentrata di nematodi. TE 30 vermi per ogni tre-dieci microlitri. Infine, depositare circa 30 L di animali di uno stadio su ciascun pozzetto della preparazione batterica.

Piastre a 24 pozzetti: più di 30 animali per pozzetto possono causare la morte per fame. Dopo che le gocce si saranno asciugate, cosa che richiederà alcuni minuti, fissare il coperchio con un elastico, incubare gli animali in posizione capovolta alla temperatura e per la durata richieste, quindi analizzare gli animali allo stadio desiderato. Una volta che i nematodi sono pronti per essere sottoposti a screening, verificare che i controlli positivi e negativi producano i fenotipi attesi. Successivamente, osservare gli animali sperimentali per rilevare eventuali anomalie nello sviluppo.

Successivamente, utilizzando un microscopio stereoscopico, montare da otto a dodici animali da ogni pozzetto su vetrini con Agri PET al 4% con una goccia di cinque microlitri di anestetico. Dopo aver applicato il coprioggetto appropriato, osservare almeno cinque animali utilizzando un microscopio composto. Mantenere un database organizzato del gene, del numero di animali osservati e dei risultati fenotipici.

Per ogni esperimento di RNAi, verificare il fenotipo prodotto dall'RNAi su R mediante un ulteriore fenotipo secondario, se possibile, e ripetendo l'esperimento; gli esperimenti ripetuti possono utilizzare batteri provenienti dalla stessa linea. Linee più vecchie potrebbero dare origine a una scarsa crescita nei coltivi liquidi notturni e andrebbero prima rigettate. Alcuni ceppi batterici potrebbero non svilupparsi adeguatamente a causa del prodotto genico espresso nel loro plasmide.

In questo caso, concentrare semplicemente i batteri prima della semina. Per uno screening in corso, è importante mantenere sempre a disposizione un numero elevato di embrioni pronti per lo stadio. Il ceppo utilizzato per lo screening deve essere sempre nutrito, mai sottoposto a digiuno, e privo di contaminanti che potrebbero influenzare il fenotipo di interesse.

Abbiamo stabilito un programma di mantenimento per l'alimentazione degli animali. I geni che influenzano la localizzazione di DBL uno sono stati identificati mediante RNAi utilizzando una linea progettata appositamente per questo schermo. L'espressione normale del marcatore GFP associato a dbl uno comprende i corpi cellulari del cordone nervoso ventrale e una fila di puntini in animali alimentati con RNA antisenso verso DBL.

Un mRNA ha mostrato un'espressione fortemente attenuata di DBL uno. Anche questi animali erano di piccole dimensioni, simili agli animali privi di DBL L uno funzionale. Lo schermo di RNA I ha identificato con successo molte altre proteine i cui prodotti influenzano la localizzazione di DBL uno, ampliando così la nostra comprensione del modo in cui il TGF beta viene trasportato a livello subcellulare e fornendo un punto di partenza per numerose ulteriori indagini.

Utilizzando questo metodo, una singola persona può ragionevolmente preparare e osservare da due a quattro serie di esperimenti ogni settimana. Ad esempio, gli animali preparati il lunedì e il martedì possono essere osservati rispettivamente il giovedì e il venerdì, e nuovi animali possono essere nuovamente preparati il venerdì e il sabato per essere osservati il lunedì e il martedì. Osservazione durante l'intero svolgimento dello screening.

È importante mantenere un numero elevato di embrioni pronti per lo staging, quindi occorre coltivare regolarmente il ceppo utilizzato per lo screening. Inoltre, è fondamentale prendere appunti dettagliati su tutte le osservazioni.