High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate
28 giugno 2012
Gli assemblaggi genomici basati su tecnologie di sequenziamento del DNA massicciamente parallele sono solitamente altamente frammentati. Lo sviluppo di mappe cromosomiche fisiche può potenzialmente migliorare gli assemblaggi genomici. Qui, illustriamo approcci innovativi alla preparazione dei cromosomi, all'ibridazione fluorescente in situ e all'acquisizione delle immagini, che aumentano in modo significativo il rendimento nello sviluppo delle mappe fisiche.
L'obiettivo generale di questa procedura è mappare sonde di DNA su cromosomi politanici di zanzara mediante una preparazione cromosomica ad alta pressione, seguita da ibridazione fluorescente in situ C due e imaging automatizzato. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto strisci cromosomici politanici utilizzando un metodo ad alta pressione. Il passaggio successivo della procedura consiste nel preparare sonde fluorescenti etichettando il DNA genomico retrostante con il fluorocromo mediante un protocollo di traduzione a nick.
Il terzo passaggio consiste nell'eseguire l'ibridazione fluorescente in C due utilizzando sistemi automatizzati per la colorazione di vetrini. L'ultimo passaggio prevede la scansione e la ripresa fotografica dei cromosomi marcati mediante un sistema automatico di imaging fluorescente. In definitiva, le immagini possono mostrare la localizzazione di una sonda di DNA marcati fluorescentemente sul cromosoma poli.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come un protocollo standard di ibridazione in situ manuale, è che il protocollo di mappatura fisica ad alto rendimento produce risultati più coerenti e riduce in modo significativo il tempo di manipolazione. Questo protocollo inizia sezionando femmine emizigoti e omozigoti circa 25 ore dopo l’alimentazione con sangue per raccogliere le loro ovaie quando si trovano allo stadio tre di Christopher. A questo stadio, la zona trasparente con le cellule del nutrice all’interno dei follicoli deve avere una forma rotonda; raccogliere le ovaie da cinque femmine e fissarle in 500 microlitri di soluzione modificata di car noise appena preparata.
Possono quindi essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di 24 ore o più a lungo a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, immediatamente prima di preparare i vetrini per la dissezione delle ovaie, preparare la soluzione di carnoys e acido propionico al 50%. Posizionare ogni coppia di ovaie in una goccia di soluzione di carnoys fresca su un vetrino privo di polvere sotto un microscopio stereoscopico.
Dividere le ovaie con l'ago da dissezione. Trasferire tutti i pezzi di ovaio su sei vetrini puliti con acido propionico al 50%. Separare i follicoli l'uno dall'altro utilizzando aghi da dissezione.
Quindi rimuovere eventuali tessuti residui con un tovagliolo di carta. Aggiungere un'altra goccia di acido propionico al 50% e attendere da tre a cinque minuti. Si osserva che i follicoli rimangono in acido propionico al 50% per tre-cinque minuti, condizione che migliora significativamente la diffusione dei cromosomi.
Successivamente, applicare un coprioggetto e attendere un altro minuto per diffondere i nuclei. Avvolgere il vetrino con carta da filtro e plastica. Impostare un Dremel tra 3.000 e 5.000 giri al minuto e, per circa un minuto, ruotare leggermente la punta del Dremel in movimento contro il coprioggetto.
Verificare la qualità dello strato con un microscopio a contrasto di fase ed applicare il dremel per un periodo più lungo, se necessario, per appiattire i cromosomi. Posizionare un secondo vetrino coprioggetto accanto al primo, quindi inserire i vetrini coprioggetto tra un altro microscopio. Successivamente, avvolgere i vetrini con un foglio di plastica e carta filtrante, quindi inserire i vetrini avvolti in una morsa per comprimerli tra 85 e 120 inch pound.
Dopo aver appiattito i cromosomi su tutte e sei le diapositive, svolgere le diapositive e rimuovere quelle aggiuntive per appiattire ulteriormente i cromosomi. Incubare le diapositive a 55 gradi Celsius per 10-15 minuti in un sistema di denaturazione e ibridazione per diapositive. Successivamente, immergere una diapositiva in azoto liquido per almeno 15 secondi o fino a quando non cesserà il bollicionamento.
Quindi rimuovere rapidamente il coprioggetto con una lametta e posizionare immediatamente il vetrino in etanolo freddo al 50% per cinque minuti. Ripetere questo procedimento per ogni vetrino in modo sequenziale. Disidratare i vetrini in bagni di etanolo al 70%, al 90% e al 100%.
Immergerli in ogni bagno per cinque minuti. Infine, dopo che i vetrini si sono asciugati all'aria, sono pronti per la FISH di colorazione. Un dispositivo automatizzato esegue la maggior parte dei passaggi della procedura, ad eccezione dell'etichettatura della sonda.
Quindi, prima di caricare il dispositivo, preparare la sonda fluorescente etichettando il DNA con il fluorocromo utilizzando un protocollo commerciale di traduzione NIC. Con la sonda preparata, caricare i vetrini e i reagenti nell'apparecchio automatico per la colorazione. Programmare il sistema per eseguire i seguenti passaggi. In primo luogo, fornire 800 microlitri di una XPBS per 20 minuti.
In secondo luogo, asciugare le vetrate con un getto di aria calda. In terzo luogo, fissare le vetrate con 450 microlitri di formalina al 4% in uno XPBS per un minuto. Quindi lavare le vetrate con etanolo al 100% per un secondo, due volte e per due minuti.
Dopo il bagno in etanolo, asciugare nuovamente le lamelle con un getto d'aria. Riscaldare ora le lamelle a 45 gradi Celsius per due minuti per evitare la formazione di bolle. Applicare quindi 20 microlitri della sonda di DNA, seguiti da una goccia di olio minerale e da un'ulteriore coprioggetto; successivamente, denaturare i cromosomi a 90 gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi impostare le diapositive per l'ibridazione a 42 gradi Celsius per 14 ore. Dopo l'ibridazione, eseguire i lavaggi di stringenza per due minuti a 42 gradi Celsius, seguiti da quattro applicazioni consecutive di due XSSC di un secondo ciascuna e asciugatura. Applicare quindi 800 microlitri di 0,4 XSSC a 42 gradi Celsius per 10 minuti, due volte, seguiti da un ulteriore lavaggio e da due XSSC a 25 gradi Celsius per 10 minuti.
Ora applicare il colorante, 50 microlitri di yo-yo uno, seguito da olio minerale e da coprioggetti. Incubare i vetrini a 25 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente rimuovere i coprioggetti.
Lavare i vetrini in due XSSC quattro volte per un secondo per ogni lavaggio e asciugarli soffiando. Infine, applicare 15 microlitri di reagente antiossidante prolungato gold su ogni vetrino e applicare nuovi coprioggetti. Accendere il sistema automatico di scansione Accord plus, iniziando dall'alimentatore Olympus U-R-F-L-T per una lampadina alogena.
Quindi il computer e, infine, il microscopio con un'unità fotografica. Aprire ora innanzitutto il pacchetto software duet, impostare una pre-scansione 10x. Fare clic sul pulsante online, inserire un nuovo ID caso e assegnare un ID vetrino.
Fare clic sul punto contrassegnato come bf. Questa è l'opzione campo chiaro. Selezionare una modalità di scansione per una pre-scansione a 10x.
Selezionare 2, cerchio 500x, cerchio 10.000x o rettangolo. Fare clic su imposta ed eseguire. Quindi, ok, seguire le indicazioni per regolare correttamente la scansione e successivamente fare clic su fine.
Per avviare la scansione, premere la scheda principale per tornare alla schermata principale. Ora fare clic sul pulsante offline, individuare l'ID del caso e l'ID del vetrino assegnati e fare clic su offline.
Scansionare nella casella nera nell'angolo in alto a sinistra. Fare clic su una freccia e selezionare pre-scan 10x. Utilizzare le frecce per scorrere le immagini scansionate dopo aver trovato un'immagine di interesse.
Fare doppio clic sullo schermo al centro della regione target e premere acquisisci. Questo consentirà di selezionare un'immagine da catturare in un momento successivo, dopo aver scelto tutte le zone di interesse. Fare clic con il tasto destro su ciascuna immagine, selezionare classifica, scegliere pre-scan 10 x e selezionare politan.
Ritorna al menu principale e configura la pre-scansione 40x. Seleziona nuovamente online e scegli un vetrino. Cambia BF in ffl e modifica il nome dell'attività in revisit dash X 40 dash rg.
Modificare la sezione immediatamente sotto l'ultima impostazione per rivedere completamente dash. Quindi eseguire il programma e seguire le istruzioni. Per configurare l'automazione, fare clic sul pulsante avvia abbinamento viste per abbinare le immagini a 10 x e 40 x.
Fare clic su fine per avviare la scansione. Al termine, fare clic su classifica e osservare le immagini. Preparazioni di cromosomi politenici delle cellule nutrici ovariche di femmine di anomaly Gambia sono state ottenute utilizzando la tecnica ad alta pressione.
Questo metodo non danneggia né altera la maggior parte della struttura cromosomica. Appiattisce i cromosomi piegati, rivelando così bande fini nascoste che non sono visibili su preparati normali. Il cromosoma è stato sottoposto a ibridazione con cloni di DNA inverso ottenuti dalla libreria inversa di S Gambia nd Tam.
La libreria è stata generata da larve di primo stadio di entrambi i sessi della ceppa parassitaria di Anopheles gambiae. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire un mappaggio fisico ad alto rendimento automatizzato, al fine di facilitare lo sviluppo rapido di assemblaggi genomici basati sui cromosomi.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo ad alto rendimento per la mappatura di sonde di DNA su cromosomi politanici di zanzara. Utilizzando una preparazione cromosomica ad alta pressione e tecniche di imaging automatizzate, il metodo migliora l'efficienza e la coerenza nello sviluppo di mappe fisiche.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Genomica
- Mappatura cromosomica
- Ibridazione fluorescente in situ
Sfondo
- Gli assemblaggi del genoma ottenuti dal sequenziamento del DNA sono spesso frammentati.
- Le mappe cromosomiche fisiche possono migliorare la qualità degli assemblaggi genomici.
- Tecniche innovative possono aumentare il throughput nel mapping fisico.
- I sistemi automatizzati possono ridurre il tempo di manipolazione manuale nelle procedure di laboratorio.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo ad alto rendimento per la mappatura cromosomica.
- Dimostrare l'efficacia dell'imaging automatizzato nello sviluppo di mappe fisiche.
- Migliorare la coerenza dei risultati rispetto ai metodi tradizionali.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di cromosomi ad alta pressione da ovari di zanzara.
- Etichettatura con sonda fluorescente mediante protocollo di traduzione di Nick.
- Ibridazione fluorescente in situ automatizzata.
- Acquisizione automatica di immagini per la localizzazione cromosomica.
Risultati principali
- Il protocollo produce allargamenti cromosomici consistenti e di alta qualità.
- I sistemi automatizzati riducono in modo significativo il tempo necessario per il mapping fisico.
- Le immagini mostrano efficacemente la localizzazione delle sonde di DNA marcate con fluorescenza.
- Il metodo aumenta la produttività rispetto ai protocolli manuali.
Conclusioni
- Questo protocollo ad alto rendimento rappresenta un notevole progresso nel mappaggio cromosomico.
- L'automazione migliora l'efficienza e la coerenza nel mappaggio fisico.
- Le tecniche illustrate possono essere applicate ad altri studi genomici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il mappaggio fisico di cromosomi ad alto rendimento affronta un collo di bottiglia critico nella qualità dell'assemblaggio del genoma, influenzando direttamente le analisi genomiche successive e gli studi evolutivi. Permettendo la localizzazione rapida e coerente di sonde di DNA, questo approccio contribuisce a ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi e migliora l'affidabilità predittiva nei flussi di lavoro di genomica comparativa. L'integrazione dell'automazione riduce il tempo di manipolazione manuale e aumenta la riproducibilità, posizionando questo metodo come una capacità scalabile per progetti di sequenziamento su larga scala.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'architettura genomica e la chiarificazione della localizzazione genica in relazione ai tratti fenotipici.
- Valore operativo: Riduce l'ambiguità nell'annotazione genica assegnando contig a posizioni cromosomiche specifiche.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione dei rischi meccanicistici migliorando la fiducia nell'inferenza della funzione genica attraverso un'accurata mappatura fisica.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Produce vetrini cromosomici standardizzati ad alta risoluzione, adatti per saggi basati su FISH riproducibili.
- Valore operativo: I sistemi automatizzati di colorazione e acquisizione delle immagini aumentano la produttività e riducono la variabilità nel rilevamento della localizzazione delle sonde.
- Prontezza del saggio: Genera output spaziali quantificabili che consentono il confronto tra varianti genetiche o condizioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Facilita l'analisi evolutiva e la ricostruzione filogenetica assegnando orientamento e posizione ai contig di sequenziamento.
- Rilevanza del Modello Preclinico: Supporta gli studi sulla competenza vettoriale permettendo la genomica comparativa tra specie trasmettitori e non trasmettitori di malattie.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Migliora la qualità dell'annotazione del genoma, riducendo i falsi positivi nei processi di identificazione dei bersagli.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal sequenziamento iniziale del genoma all'annotazione e all'analisi comparativa, in particolare quando è necessaria una risoluzione della mappa fisica per risolvere lacune nell'assemblaggio o assemblaggi errati.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo all'ordine genico, alla sinthenia e all'evoluzione cromosomica in modelli rilevanti per le malattie.
- Screening: Permette flussi di lavoro FISH standardizzati e automatizzati per la convalida ad alto rendimento delle sonde e lo screening della localizzazione.
- Analisi: Genera output basati sulla posizione spaziale e sull'intensità che consentono il confronto quantitativo del legame delle sonde tra cromosomi o campioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il mappaggio fisico all'inferenza evolutiva e alla scoperta di biomarcatori negli studi di genomica comparativa.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile e automatizzata per il mappaggio fisico applicabile a più specie e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nell'annotazione genica e riduce l'ambiguità meccanicistica nell'interpretazione dei dati genomici.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità attraverso l'automazione dei passaggi di colorazione, ibridazione e acquisizione delle immagini.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o abbandono nella selezione dei bersagli, potenziando l'affidabilità del montaggio del genoma e riducendo i falsi positivi biologici.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli genomici adeguata al rischio grazie a una qualità superiore del montaggio e a una maggiore comprensione evolutiva.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella preparazione dei cromosomi, nei protocolli FISH e nei sistemi di imaging automatizzati.
- È subordinato all'accesso a strumenti per la preparazione ad alta pressione, coloratori automatici per vetrini e microscopi a fluorescenza motorizzati.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per l'etichettatura delle sonde, le condizioni di ibridazione e le procedure di analisi delle immagini.
- L'adattamento a diversi sistemi modello può richiedere l'ottimizzazione dei passaggi di spalmatura e denaturazione dei cromosomi.
- I limiti pratici includono la dipendenza da cromosomi politenici di alta qualità e l'idoneità principalmente ai genomi di ditteri che presentano stadi politenici.
