Generazione, purificazione e caratterizzazione di specie DISC1 Cell-invasive Protein

L'obiettivo generale delle seguenti procedure è generare dischi purificati. Uno aggregato in grado di invadere le cellule riceventi. Verranno dimostrati due metodi diversi per raggiungere questo obiettivo, con il primo metodo.

La proteina fluorescente disc uno che forma l'asoma è sovraespressa nelle cellule donatrici umane di neuroblastoma NLF. Le cellule vengono quindi lavate con PBS, raccolte e lisate senza l'uso di detergenti. Il DNA viene digerito e le zone di agarosio vengono purificate mediante un sistema a gradiente di saccarosio.

Agrios purificati con questo metodo presentano una bassa efficienza di invasione cellulare. L'approccio alternativo consiste nell'overesprimere gli amminoacidi da 5 98 a 7 85 della proteina ricombinante disc uno in e coli. Il frammento proteico viene quindi marcato con DITE 5 94, dializzato e purificato mediante una matrice NI NTA, che rimuove qualsiasi residuo di colorante non legato e il disc multimerico.

I frammenti generati con questo metodo presentano un'elevata efficienza di invasione cellulare per valutare l'invasione delle cellule ospiti. Sia il disco purificato della proteina fluorescente, i risomi, sia il disco ricombinante marcato. Un frammento viene incubato con le cellule riceventi di interesse.

Viene quindi aggiunto il blu trian per eliminare la fluorescenza extracellulare e l'invasione viene visualizzata mediante microscopia confocale. Finora, l'aggregazione proteica non è stata riconosciuta come una caratteristica delle malattie mentali croniche come la schizofrenia. Dove la proteina interrotta nella schizofrenia uno è un fattore di invasività cellulare, l'aggregazione proteica rappresenta una caratteristica distintiva delle malattie da alterazione conformazionale delle proteine.

Qui mostriamo con due metodi che gli aggregati proteici del disco uno sono invasivi per le cellule e che quindi i disturbi legati al disco uno o le neuropatie da disco uno sono malattie conformazionali delle proteine. I due metodi sono, in primo luogo, la purificazione del disco completo, un ASOS, da linee cellulari di neuroblastoma e, in secondo luogo, l'espressione di un frammento multimerico del dominio C-terminale del disco uno in e coli, nonché la purificazione e la marcatura con un colorante fluorescente.

Sebbene il primo metodo porti solo a un'invasione cellulare scarsamente efficiente dello 0,3% delle cellule che incorporano i microsomi purificati, il frammento proteico ricombinante pur infetta fino al 20% delle cellule esposte. I metodi qui descritti dovrebbero essere trasferibili ad altre proteine per le quali la formazione dell'acrosoma o l'assemblaggio multimerico siano stati dimostrati in modo convincente. In ciascuna delle 10 piastre da 10 centimetri.

Seedinare 1,5 volte 10 alla sesta cellule di neuroblastoma umano e cellule LF in mezzo RPMI 1640 integrato e far crescere per tutta la notte. Il giorno successivo, le cellule dovrebbero essere confluenti al 70-80%. Etichettare cinque piastre per la trasfezione con PC DNA 3.1 MRFP e disc umano completo etichettato con EGFP e altre cinque piastre per la trasfezione con plasmide EGFP da solo. Per ogni piastra da 10 centimetri, combinare 15 microgrammi di DNA plasmidico, 30 microlitri di metilene tetrafluorato e 750 microlitri.

Opti MEM in un tubo microcentrifuga e mescolare aspirando e dispensando con una pipetta, incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi, per trasfettare le cellule, aggiungere goccia a goccia la soluzione del reagente di trasfezione del DNA alle cellule e incubare le cellule a 37 gradi Celsius con 5% CO₂. Dopo 48 ore dalla trasfezione, monitorare l'espressione della proteina fluorescente MRFP a lunghezza intera Disc uno e confermare la formazione di agrozone mediante microscopia a fluorescenza. Alcune cellule ospitano inclusioni massicce di proteina fluorescente come mostrato in questo caso.

Questo protocollo combina un metodo per purificare i corpi di Lewy dal tessuto cerebrale e il protocollo per isolare aggregati più grandi o agro zone, poiché i metodi già esistenti si basano sull'uso di detergenti, ed è fondamentale isolare proteine prive di detergenti per l'utilizzo in saggi di invasività cellulare. Successivamente, aspirare il mezzo di lavaggio con PBS e aggiungere 400 microlitri di PBS contenente un cocktail di inibitori della proteasi. Quindi raschiare le cellule e aggiungere un millilitro di sospensione cellulare e 10 sfere ceramiche in un tubo di lisi da due millilitri.

Lisare le cellule utilizzando tre impulsi di 62° su un omogeneizzatore pre-cell lyse 24. La forza meccanica del processo può aumentare la temperatura all'interno del campione a oltre 37 gradi Celsius. Pertanto, si deve fare attenzione a raffreddare il campione sul ghiaccio. Dopo la procedura di lisi, una volta raffreddate le cellule sul ghiaccio, aggiungere cloruro di magnesio 10 millimolare e 40 unità per millilitro di DNAA e incubare per 60 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione.

Preparare 10 millilitri ciascuno di saccarosio all'80%, al 50% e al 20% peso/volume in PBS. Successivamente, in un tubo conico da 15 millilitri, preparare il gradiente di saccarosio iniziando con due millilitri di saccarosio all'80%, seguiti da due millilitri al 50% e da due millilitri al 20%. Versare il gradiente lentamente e fare attenzione a non disturbare gli strati già versati.

Successivamente, stratificare il lisato digerito sulla parte superiore del gradiente e centrifugare per 15 minuti a 1000 ×g a quattro gradi Celsius. Con l'interruzione, raccogliere con attenzione l'interfaccia tra il 50 e l'80% dello strato di saccarosio mediante pipetta e mescolare con cinque volumi di un tubo conico da 15 millilitri; centrifugare per 15 minuti a 1000 ×g a quattro gradi Celsius. Rimuovere con cura il soprannatante e conservare il pellet contenente la zona agri.

Ripetere il lavaggio altre due volte in questa interfaccia. Le agro zone sono fluorescenti e possono essere visualizzate al microscopio sotto luce UV dopo l'ultimo lavaggio; scartare il soprannatante e risospendere il pellet in 250-500 microlitri di PBS. Questo pellet contiene le agro zone purificate.

Aggiungere 10 microlitri di disco MRFP, una sospensione asoma, in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente cellule di neuroblastoma umano SHSY-5Y. Esprimere costitutivamente il disco GFP solubile con un'estremità C legata a coprislip di vetro sterili e incubare per 48-72 ore; al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS e bloccare la fluorescenza extracellulare con blu di trian allo 0,04% per cinque minuti.

Quindi lavare con PBS per rimuovere il trian blu. Successivamente, posizionare la piastra sul ghiaccio e aggiungere PFA al 4% in PBS per 10 minuti per fissare le cellule. Poi eseguire un lavaggio con acqua sterile e montare i coverslip su vetrini utilizzando il mezzo di montaggio Prolong Gold con DPI.

Confermare l'assunzione nell'invasione in modo esogeno. Applicare le zone di aggregazione mediante codistribuzione con le proteine reclutate espresse dalle cellule riceventi in immagini Zack. Questo Zack comprende circa sei micrometri di profondità.

24 immagini acquisite a intervalli di 200 nanometri. La fluorescenza del disco MRFP di una zona agri mostrata in rosso recluta il terminale citosolico GFPC del disco. Un frammento mostrato in verde indica colocalizzazione di colore giallo, dimostrando che le zone agri sono entrate nel citosol del ricevente e hanno reclutato la proteina del disco uno precedentemente solubile.

In questa parte del protocollo, il disco umano uno verrà etichettato con DITE 5 94. Questo D consente il monitoraggio diretto della proteina ricombinante senza la necessità di ulteriori colorazioni immunoistochimiche. Iniziare liberando la proteina preparata come descritto nel documento allegato dal beam mercaptoetanolo, dializzandola tre volte in due litri di PBS a una diluizione di uno a 2000.

Etichettare successivamente un disco da un milligrammo con DITE 5 94 IDE, sciogliere un milligrammo per millilitro di proteina in PBS e aggiungere TCEP a 5 millimolari per recuperare i gruppi SH liberi; aggiungere 20 microlitri del colorante disciolto in DMF alla reazione e incubare per due ore a temperatura ambiente. Utilizzando un cassetto di dialisi SLI con cutoff di peso molecolare di 10.000 Daltons, dializzare la proteina tre volte in PBS in un rapporto di 1 a 2000, per due ore ogni volta. Successivamente, per aumentare ulteriormente la purezza della proteina etichettata.

Viene eseguita una purificazione per affinità basata su un marcatore his su una colonna NI NTA. Lavare un millilitro di matrice NI NTA con 10 millilitri di PBS, quindi applicare alla colonna la proteina dializzata marcata e farla passare attraverso la colonna.

Gradualmente la soluzione perderà parte del suo colore blu a causa del legame della proteina alla matrice NTA; il colorante libero non marcato rimarrà nel flusso passante. Una volta che la soluzione proteica è entrata nella colonna, lavare la colonna tre volte con 20 millilitri di PBS per eluire la proteina; aggiungere quindi due millilitri di PBS contenente 500 millimolari di ole alla colonna.

Impostare la valvola su velocità ridotta ed eluire goccia a goccia, monitorando la banda colorata sulla colonna N NI NTA. Per essere chiarito, questa frazione colorata dell'eluito contiene una proteina ricombinante marcata; trasferire l'EIT in una cassetta per dialisi SLI e dializzare l'EIT tre volte in NAPI 10 millimolare, con un rapporto di diluizione di 1 a 2000, per due ore ciascuna in due litri. Dopo la dialisi, spingere l'EIT attraverso un filtro sterile da siringa da 0,45 micrometri, quindi suddividere in aliquote di 100 microlitri per cinque volte e congelare rapidamente in azoto liquido.

La quantità totale di proteina deve essere compresa tra 0,5 e un microgrammo per millilitro in ogni aliquota di 100 microlitri. Per valutare l'invasività della proteina, aggiungere del mezzo contenente da cinque a 10 microgrammi per millilitro della proteina ricombinante disc marcata a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y riceventi, costitutivamente esprimenti il marcatore GFP solubile al termine C di disc su coprioggetti di vetro sterili, e incubare per 48-72 ore.

Spegnere la fluorescenza extracellulare, fissare e montare le cellule come fatto per le cellule trattate con agri-zona, confermando l'invasione della proteina ricombinante esogenamente applicata mediante Zack Imaging. Quando la proteina marcata viene internalizzata, viene rilevata all'interno del perimetro delle cellule riceventi nelle immagini ottenute mediante microscopia confocale. Questo Zack comprende una profondità di circa cinque micrometri in 24 passi di 220 nanometri.

Qui, il frammento ricombinante del dominio uno del disco, da 598 a 785, mostrato in rosso, viene internalizzato da cellule riceventi che esprimono la forma solubile del dominio uno del disco marcata con GFP all'estremità C-terminale, mostrata in verde, per determinare l'invasività della proteina disco uno. Aggregati di acrosomi costituiti da disco uno completo marcato con MRFP sono stati purificati da cellule NLF e applicati su cellule riceventi SH-SY5Y come descritto in questa immagine. L'acrosoma di disco uno marcato con A-M-R-F-P ha invaso una cellula di neuroblastoma umano SH-SY5Y che esprime la forma solubile di disco uno marcata con GFP all'estremità C-terminale.

Inoltre, il disco uno asomo marcatto con MRFP è stato in grado di reclutare il disco uno solubile marcato con GFP in aggregati insolubili per determinare l'invasività; il disco uno ricombinante etichettato con DIA light è stato applicato a cellule di neuroblastoma SH-SY5Y che esprimono disco uno solubile marcato con GFP, come mostrato qui. La proteina ricombinante disco uno, mostrata in rosso, ha invaso la cellula ricevente; i puntini gialli indicano il reclutamento del disco uno solubile marcato con GFP all'estremità C-terminale in aggregati. Il disco uno ricombinante espresso e purificato da E. coli si è dimostrato altresì invasivo per le cellule neuronali in vivo, quando la proteina multimerica è stata iniettata stereotassicamente nella corteccia prefrontale mediale di un ratto. L'immagine di Zack conferma la presenza della proteina ricombinante disco uno nei neuroni corticali del ratto, evidenziata mediante colorazione con un anticorpo contro i nuclei neuronali.

Abbiamo appena illustrato due metodi per generare aggregati della proteina disc uno allo scopo di studiare l'invasione cellulare. Utilizzando uno di questi metodi, possiamo analizzare gli effetti cellulari derivanti dall'assorbimento degli aggregati di disc uno, evitando le potenziali variabili disturbanti legate all'espressione genica ricombinante indotta dalla trasfezione di DNA estraneo. Queste tecniche possono essere applicate per indagare gli effetti biologici della patologia proteica di disc uno in vitro nelle cellule, nonché in vivo mediante inoculazione intracerebrale o altre vie di somministrazione in modelli animali.

Siamo certi che queste tecniche potranno essere trasferite anche ad altri aggregati proteici, eventualmente con lievi modifiche al protocollo adottato per ciascuna proteina specifica. Quando si esegue questa procedura, assicurarsi di dedicare tempo a un'analisi accurata delle immagini di microscopia confocale.