Metodi per l'elettroporazione e la conferma della trasformazione in Limosilactobacillus reuteri DSM20016
23 giugno 2023
Qui, presentiamo i protocolli per lavorare con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, dettagliando la crescita, la trasformazione plasmidica, la PCR delle colonie, la misurazione della proteina reporter fluorescente e la mini-preparazione limitata del plasmide, nonché problemi comuni e risoluzione dei problemi. Questi protocolli consentono la misurazione delle proteine reporter in DSM20016, o la conferma tramite colony PCR se nessun reporter è coinvolto.
L.Reuteri, e in particolare il ceppo, DSM20016 è un commensale intestinale umano robusto e naturale, con grandi promesse per la consegna terapeutica e il rilevamento di malattie in tutto il tratto gastrointestinale. Questo lavoro aiuterà a posizionare DSM20016 come un telaio di biologia sintetica per questo tipo di applicazioni. I lactobacillales non hanno un organismo modello specifico.
Le specie preferite esistono, ma di solito sono scelte con un pregiudizio verso particolari obiettivi di ricerca. La variazione all'interno della famiglia batterica ha portato a protocolli frammentati, alcuni con iterazioni di modifiche che risalgono attraverso le pubblicazioni. È molto difficile per le persone che iniziano a filtrare esattamente ciò che è utile e ciò che non lo è.
Un documento per la trasformazione di DSM20016 esiste, ma non è moderno. Esistono protocolli moderni per altri membri della famiglia Lactobacillales, ma non sono DSM20016. Qui ci sforziamo di fornire un set di protocolli facile da usare, centralizzato, modernizzato e completo per DSM20016 elettroporazione.
Questo set di protocolli offre una modernizzazione sostanziale rispetto al precedente protocollo di esplorazione DSM20016 e chiarisce alcuni fili sospesi, oltre a sottolineare parti che in precedenza erano meno chiare. Anche il set di protocolli è completo, e specificamente per DSM20016, un ceppo per il quale altri protocolli non DSM20016 non sono totalmente compatibili. Uno dei nostri obiettivi principali è l'utilizzo di microbi come sensori e sistemi di consegna economici.
Stiamo lavorando con esperti di malattie intestinali per utilizzare DSM20016 per rilevare le condizioni nel tratto gastrointestinale e fornire terapie come richiesto.
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Panoramica
Questo articolo presenta protocolli per il lavoro con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, un commensale resistente del tratto intestinale umano. I protocolli includono la crescita batterica, la trasformazione plasmidica, la PCR su colonie e la misurazione di proteine reporter fluorescenti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Biologia Sintetica
- Salute Gastrointestinale
Sfondo
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016 è un commensale naturale del tratto intestinale umano.
- Questo ceppo mostra potenzialità per la somministrazione terapeutica e il rilevamento di malattie.
- I protocolli in questo settore sono spesso frammentati e difficili da seguire.
- Gli obiettivi della ricerca possono influenzare la scelta della specie batterica.
Scopo dello studio
- Fornire protocolli chiari per il lavoro con DSM20016.
- Facilitare la misurazione delle proteine reporter e la conferma mediante PCR su colonie.
- Individuare problemi comuni e risolvere i guasti nei protocolli.
Metodi Utilizzati
- Crescita di Limosilactobacillus reuteri DSM20016.
- Tecniche di trasformazione plasmidica.
- PCR su colonie per la conferma delle modifiche genetiche.
- Misurazione delle proteine reporter fluorescenti.
Risultati principali
- Sono stati stabiliti protocolli di crescita e trasformazione con successo.
- La PCR su colonie ha confermato la presenza dei costrutti genetici desiderati.
- Le proteine reporter fluorescenti sono state misurate in modo efficace.
- Sono state fornite linee guida per la risoluzione dei problemi relativi a inconvenienti comuni.
Conclusioni
- I protocolli migliorano l'usabilità del DSM20016 nella ricerca.
- Forniscono una base per future applicazioni di biologia sintetica.
- Indicazioni chiare aiutano i ricercatori a orientarsi nella letteratura frammentata.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I protocolli centralizzati e specifici per ceppo di elettroporazione e conferma della trasformazione per Limosilactobacillus reuteri DSM20016 colmano una lacuna fondamentale nello sviluppo di piattaforme sintetiche per applicazioni mirate all'intestino. I flussi di lavoro standardizzati riducono l'ambiguità e consentono l'ingegnerizzazione riproducibile di microrganismi commensali per la somministrazione terapeutica e il rilevamento di malattie. Ciò colloca DSM20016 come una piattaforma affidabile per la ricerca e sviluppo biotecnologica nelle fasi iniziali, finalizzata alla salute gastrointestinale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente una manipolazione genetica robusta del DSM20016 per l'analisi funzionale del bersaglio.
- Permette la riduzione del rischio biologico chiarificando la fattibilità della trasformazione in un ceppo commensale chiave.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione dei ceppi per i processi di biologia sintetica.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce protocolli validati per la preparazione di DSM20016 come chassis pronto per lo screening.
- Standardizza la trasformazione e la misurazione dei reporter per ottenere risultati di saggio riproducibili.
- Permette una valutazione affidabile di costrutti ingegnerizzati in un sistema rilevante per la malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea DSM20016 ingegnerizzato agli obiettivi traslazionali per la somministrazione terapeutica mirata all'intestino.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica in modelli gastrointestinali.
- Riduce il rischio nel progresso dei microrganismi commensali ingegnerizzati verso studi traslazionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questi protocolli si integrano all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e lo sviluppo del saggio, consentendo un percorso semplificato dall'ingegneria genetica allo screening funzionale in DSM20016.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi e l'ingegnerizzazione di percorsi metabolici in un ceppo commensale.
- Screening: Permette trasformazioni riproducibili e letture quantitative dei reporter per flussi di lavoro successivi.
- Analisi: Consente la misurazione dell'efficienza di trasformazione e dell'espressione dei reporter per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Fornisce una base per la valutazione preclinica di ceppi ingegnerizzati in contesti pertinenti all'intestino.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce DSM20016 come piattaforma standardizzata e riutilizzabile per la ricerca e sviluppo in biologia sintetica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nell'ingegneria dei microrganismi commensali.
- Valore operativo: Fornisce protocolli standardizzati, riproducibili e scalabili per la manipolazione di ceppi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale nei programmi precoci sul microbioma intestinale.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei terapeutici microbici ingegnerizzati adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in genetica microbica e tecniche di elettroporazione.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per elettroporazione e lettore di piastre.
- Richiede standardizzazione tra team diversi per l'adozione del protocollo e la risoluzione dei problemi.
- Potrebbe richiedere adattamenti per altre ceppi di Lactobacillales a causa della variabilità genotipica.
- La compatibilità del protocollo è specifica per il ceppo DSM20016 e potrebbe non estendersi ad altri ceppi.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
