4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

こんにちは、ブラッド・ハミルトンです。STEM Gen社の研究開発部門に所属しています。本日は、マウス胚性線維芽細胞から人工多能性幹細胞を作製する手順についてご紹介します。

この手順は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）の作製と、リプログラミング過程の研究の両方に利用可能です。それでは、開始しましょう。まず、マウス胚性線維芽細胞（MEF細胞）を、15 cmのゼラチンコートディッシュに、1枚あたり4×10⁵ cellsの密度で播種します。

次に、30 millilitersのmeth増殖培地を加え、細胞が約80%コンフルエントになるまで、37 degrees Celsius、5%carbon dioxideで2日間インキュベートします。インキュベーション終了後、培地を吸引し、濃縮レンチウイルスを添加した30 millilitersの増殖培地を加えます。

培地が均一に広がるように、ディッシュをゆっくりと揺らします。ウイルス導入を完了させ、細胞を37°C、5% carbon dioxideで一晩培養します。次に、ドキシサイクリン誘導リプログラミングに進みます。

リプログラミングを開始するため、トランスダクションから20～24時間後にトリプシンを用いて導入済み細胞を剥離し、200 Gsで5分間遠心分離します。次に、細胞ペレット上の培地を慎重に吸引し、細胞を増殖培地で再懸濁します。懸濁後、使用する細胞培養皿のサイズに応じた適切な濃度で導入済み細胞を播種してください。

ここでは、再プログラミング効率の実験およびiPSコロニーの単離には10 cmディッシュあたり2.5 × 10⁵個の細胞を、免疫化学実験には4ウェルプレートの1ウェルあたり2 × 10⁴個の細胞を使用します。導入効率をモニターするため、細胞を37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。この段階で、必要に応じて今後の解析のために細胞を液体窒素で凍結保存することができます。

翌日、培地を吸引して除去し、ドキシサイクリンを最終濃度 2 µg/mL になるように添加した新鮮な増殖培地と交換します。また、ドキシサイクリンを含まない培地を用いた陰性対照を設けます。最後に、細胞を 37 °C、5% CO2 の条件下でインキュベートします。

リプログラミングプロセスを開始しました。一般的に、多能性幹細胞コロニーは16日から22日後に、単離に十分な大きさに成長します。

その手順を実演する前に、まず化学的な手法を用いて導入効率を検証し、導入効率を決定する必要があります。免疫化学的試験は、ドキシサイクリン誘導の48時間後に4ウェルプレートに再播種した細胞に対して行います。本プロトコルに記載されているすべての容量は、細胞培養プレートのサイズに応じて調整してください。まず、細胞を穏やかに洗浄することから始めます。

マグネシウムまたはカルシウムイオンを含まないPBSで洗浄した後、PBSで調製した4%パラホルムアルデヒド500 µLを用いて、細胞を15分間固定します。室温で、再びPBSを用いて細胞を穏やかに2回洗浄します。次に、氷冷した0.2%Tween 20含有PBSを500 µL添加し、室温で10分間インキュベートして細胞を透過処理します。

細胞をさらに2回洗浄した後、非特異的な抗体結合を阻止するため、ブロッキングバッファー 200 µLを加え、室温で1時間置きます。次に、目的の一次抗体 200 µLを加えます。

ここでは、多能性マーカーとしてT 4K LF four、SOX two、およびcmicを使用しています。細胞を4°Cで一晩インキュベートします。翌日、PBSで細胞を穏やかに2回洗浄した後、2次抗体200 µLとともに室温で1時間、遮光してインキュベートします。

ここでは、可視化のために蛍光色素が結合した適切な二次抗体を使用し、インキュベーション後に倒立蛍光顕微鏡で観察します。細胞をさらに2回洗浄し、DPIを加えて再度10分間インキュベートして核を可視化します。最後に、最終洗浄の後、抗退色封入剤（antifa aqua mount）を加え、倒立蛍光顕微鏡で細胞をイメージングして導入効率を判定します。

多能性幹細胞の単離および拡大を開始します。リプログラミングプロセスを開始した後、毎日培養の状態を観察し、48時間ごとに適切な培地を交換します。最初の12日間はドキシサイクリンを添加した培地を用いて細胞を培養し、その後、培地からドキシサイクリンを除去します。

拡張のために手動でピックアップされた誘導多能性幹細胞（iPS細胞）コロニーはドキシサイクリンで処理されます。リプログラミング過程を示す形態学的変化を確認するため、独立した細胞を毎日観察してください。実験ごとに異なりますが、一般的にコロニーはDS誘導後16〜22日の間に分離可能な大きさになります。リプログラミングされたコロニーの分離とトリプシン処理を開始する前日に準備を行ってください。

24ウェルプレートを用意し、ガンマ照射したmetsフィーダー層を1ウェルあたり5×10⁴個の密度で播種します。細胞を37°C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌日、各iPSコロニーを手作業でピックアップし、トリプシン処理して細胞凝集塊を単一細胞に解離させます。解離したiPS細胞を、事前に準備した24ウェルプレートの各ウェルにマウス胚性幹細胞培地を用いて播種し、37°C、5% CO₂条件下でインキュベートします。

24時間ごとに培地を交換します。iPS細胞コロニーの増殖とGFP蛍光を毎日観察してください。本研究では、多能性解析のために4ウェルプレートに播種するまで、培養物を6日間インキュベートしました。

24ウェルプレートのうち、GFPが均一に発現しているウェルを特定します。GFP発現良好なウェルは、トリプシン処理し、γ線照射したMESフィーダー層をあらかじめ形成した4ウェルプレートに1:8で継代します。これらのプレートを、多能性分析を開始するためのICC分析に使用します。マグネシウムおよびカルシウムイオンを含まないPBSで細胞を2回静かに洗浄します。

各ウェルに氷冷した0.2% between 20 in PBSを0.5 milliliters加え、細胞を10分間インキュベートします。PBSでさらに3回洗浄した後、200 microlitersのブロッキングバッファーを用いて室温で1時間、非特異的結合をブロックします。次に、目的の一次抗体を200 microliters加えます。

ここでは、SSEA-1、Nanog、OCT4を用い、細胞を4 °Cで一晩インキュベートしました。細胞を穏やかに2回洗浄した後、200 µLの二次抗体とともに室温で1時間、遮光してインキュベートします。ここでは、可視化のためにFluoroForceがコンジュゲートされた適切な二次抗体を使用し、倒立蛍光顕微鏡で観察します。さらに2回洗浄した後、DPIを添加し、細胞を10分間インキュベートします。

最後に洗浄を行った後、倒立蛍光顕微鏡で細胞をイメージングする前に、antifa aqua mountを添加します。iPS細胞コロニーのアルカリホスファターゼ活性は、市販のキットを用いて分析することも可能です。Stem gent docs誘導性マウスTFレンチウイルスセットを使用し、MESに導入して転写因子を発現させることで、MESをiPS細胞にリプログラミングできます。

doxycycline処理した細胞ではT four、SOX two、KLF four、およびseicが検出されますが、未処理の細胞ではほとんど、あるいは全く発現が検出されません。形態学的変化は時間の経過とともに進行し、明確なコロニー辺縁と三次元的な成長を伴う、より大型でES細胞に近いコロニーが形成されます。doxycyclineを除去すると、一部のES細胞様コロニーにおいて細胞形態の顕著な逆転が認められます。

しかしながら、多くのコロニーはiPS細胞の形態を維持していました。これらのiPSコロニーをピックアップして継代すると、アルカリホスファターゼ、nanoT4、SSEA-1といった典型的な多能性マーカーの発現が認められます。

本実験で使用したmeth細胞は、内在性のnag遺伝子座からGFPを発現しています。そのため、多能性状態にリプログラミングされた際、GFPの発現をリプログラミング成功の予備的な指標として利用することができます。ここでは、4つの転写因子を用いたドキシサイクリン誘導性アンチバイラルシステムを用いて、マウス胚性線維芽細胞を誘導多能性幹細胞へリプログラミングする方法について説明しました。

この手順を行う際、リプログラミング実験を計画するには、リプログラミング効率を最適化するためにいくつかの変数を考慮することが重要であるという点に留意してください。第一に、一次感染ステップにおいて、活性ウイルスと標的細胞の比率を変更することで、形質導入効率を増減させることができ、それによって標的細胞集団における統合ウイルスの数を制御することが可能です。第二に、細胞をドクにさらす時間を調整することで、生成されるiPSコロニーの数に影響を与える可能性があります。

第三に、標的細胞の増殖能がリプログラミングに影響を与える可能性があります。活発に成長し分裂している細胞の方が、リプログラミングを受けやすいためです。最後に、異なる細胞数や異なるサイズの組織培養ディッシュに合わせてプロトコルを修正する場合、標的細胞数を培養ディッシュの表面積に比例して調整することが推奨されます。以上で説明を終わります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。