StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

こんにちは、ブラッド・ハミルトンです。私はSTEM Gen社の研究開発部門で研究員を務めています。本日は、レンチウイルスを用いてリプログラミング因子を導入し、ヒト線維芽細胞をリプログラミングさせる手順をご紹介します。

この手順は、iPS細胞の作製とリプログラミングプロセスの研究の両方に利用できます。iPS細胞は、形態、増殖能、および体内のあらゆる組織型への分化能においてES細胞と類似しています。ヒトiPS細胞は、細胞を得るために胚を破壊するという倫理的ジレンマを伴わずにES細胞の主要な特性を示すため、ES細胞よりも明確な利点があります。

患者特異的なiPS細胞の作製は、非自己由来の移植細胞による免疫拒絶反応の可能性を排除することで、個別化再生医療における重要な障壁を解消します。それでは、手順を開始しましょう。本プロトコルのいくつかの段階で、分化中のiPS細胞（人工多能性幹細胞）の培地を、mTeSR1条件培地で交換します。

この培地の調製には6日かかります。そのため、実験開始の少なくとも1週間前から準備を始めてください。まず、6ウェルプレートの各ウェルに播種します。

2×10⁵ CFUのMEFフィーダー細胞を2 mLのMEF増殖培地と共にウェルプレートに入れ、37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌日、培地をヒトESiPS細胞培養培地に変更します。

培地を37°C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。上清を回収し、24時間ごとに新しい培地と交換することを4日間繰り返します。回収した上清を0.22 µmフィルターでろ過します。

回収した上清に15 nanograms per milliliterのBFGF (basic fibroblast growth factor)を添加します。これにより、約16 millilitersのMeth条件化培地が得られます。毎日回収した上清は、それぞれ4 °Cで保存してください。Meth条件化培地は、4 °Cで1〜2週間、または-20 °Cで数ヶ月間保存することが可能です。

meth調節培地が必要な時に準備できていることが確認できましたので、次に細胞の調製について説明します。iPSC作製における最初のタスクは、レンチウイルスを用いて、ヒト包皮線維芽細胞（BJ細胞）に幹細胞に特徴的な4つの転写因子を導入することです。導入の準備として、BJ細胞を6ウェルプレートに1 × 10⁵ cells/wellの密度で播種し、培養してください。

細胞を2 mLの増殖培地で37 °C、5% CO2条件下で一晩培養します。同日に、6ウェルプレートに水で希釈した0.1%ゼラチンを2 mLずつ加え、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートして、MEFフィーダープレートの準備を開始します。ゼラチンがウェルをコーティングし、細胞の基質として機能します。

次に、BJ細胞をレンチウイルス導入に備え、導入用のウイルスを調製します。2 mLの新鮮な培地に、6 µg/mLのpolybreneと、ヒト転写因子T4、SOX2、Nanog、Lin28をそれぞれ発現する4種類のレンチウイルスを、それぞれ同一の感染多重度（MOI）となるように添加します。

これらのレンチウイルスはすべて、ヒト初期化因子レンチウイルスセットに含まれています。導入を行うには、BJ細胞の増殖培地をウイルス含有培地に入れ替えます。培地が底面に均一に広がるように、プレートを静かに揺らしてください。

37 °C、5% carbon dioxide の条件下で一晩インキュベートします。同日に、液体窒素から cf one meth フィーダー細胞のバイアルを1本取り出し、融解させます。meth フィーダープレートからゼラチン溶液を除去します。これにより、各プレートにゼラチンコーティングが施されます。

0.2 × 10⁵個の細胞を2 mLのmeth growth Mediumに加えます。このMESを37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌日、0.05% trypsin EDTAを用いてBJ細胞を剥離し、200 ×gで5分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を吸引し、細胞を増殖培地で再懸濁します。methフィーダープレートから培地を除去し、BJ細胞懸濁液を1ウェルあたり2 mLずつ加えます。BJ細胞の濃度は、1ウェルあたり約5×10⁴個になるようにしてください。

37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。BJ細胞をメスフィーダープレートに播種してから24時間後、培地をヒトESiPS（胚性幹細胞または人工多能性幹細胞培養）培地に交換します。その後7日間、24時間ごとに培地交換を継続します。

7日目に、ES細胞培養液を2 mLのmeth条件付き培地に交換します。methフィーダー細胞は、iPS細胞の増殖に必要な可溶性因子を提供してきました。しかし、培養の状態を良好に維持するためには、さらにこれらの因子を追加する必要があります。

Methコンディショニング培地には、37 °C、5% carbon dioxideで一晩インキュベートしたmethフィーダー細胞から分泌されたすべての可溶性因子が含まれています。顕微鏡で観察し、細胞コロニーを選択します。24時間前にccf one methフィーダー細胞を播種した新しい24ウェルプレートにおいて、小さくコンパクトなドーム状の外観で区別される、選択したコロニーをヒトE-S-I-P-S培養で回収します。

10 µMのstem molecule Y 2 7 6 3 2を添加した培地。これはdependent kinase阻害剤である。最初の7日間は、24時間ごとにstem molecule Y 2 7 6 3 2を添加しない新鮮な培地に交換する。

7日後、培地をmeth. Condition培地に変更します。ヒトES細胞特有の形態を示すまで、細胞の継代を継続してください。エッジが鮮明で、小さく緻密なドーム状のコロニーを確認します。

コロニーは均一で、細胞質に対する核の比率が高いはずです。この時点で、ES細胞の形態を持つコロニーが形成されましたが、ES細胞に特徴的な遺伝子も発現しているでしょうか。それを確かめるために、TRA 180、TRA 1 60、SSEA 4、SSEA 3、T 4、sox 2、nanog、SSEA 1などの多能性マーカーでコロニーを染色します。まず、PBSで細胞を3回静かに洗浄します。

次に、500 µLの4%パラホルムアルデヒドまたはその他の固定液を用いて、室温で20分間細胞を固定します。20分後、PBSでさらに3回細胞を洗浄し、過剰な固定液を除去します。続いて、1ウェルあたり500 µLのブロッキングバッファー中で室温で1時間インキュベートし、非特異的結合をブロックします。ブロッキングステップの後、ブロッキングバッファーで1:100に希釈した一次抗体250 µLをそれぞれに加えます。

細胞を一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートし、翌日に、未結合の一次抗体を除去するためにPBSで3回洗浄します。1/300に希釈した二次抗体とブロッキングバッファーの混合液250 µLを加え、室温で1時間インキュベートします。この際、光退色を防ぐため、遮光条件下で保持してください。

PBSで細胞を3回洗浄します。3回目の洗浄後、核を染色するためにDPIを1 µg/mL添加します。最後に、iPS細胞の遺伝子発現を解析します。

顕微鏡下での形態観察の結果、T4、SOX2、Nanog、およびLin28を共導入したヒト皮膚線維芽細胞において、導入後4日目という早い段階で形態的な変化が観察され、17日目には細胞クラスターの凝集がより密になりました。単離されたiPS細胞コロニーをさらに特性解析するため、ES細胞で発現する一般的な多能性マーカーの有無を確認したところ、コロニーは強いアルカリフォスファターゼ活性を示しました。

さらに、表面マーカーであるTA 180、TRA-1-60、SSEA-4、SSEA-3、および核マーカーであるT-fosc、SOX2、Nanogを含む多能性マーカー特異的抗体パネルを用いて、iPS細胞コロニーの免疫化学染色またはICCを実施した。分離されたiPSコロニーは、すべてのマーカーに対して陽性であった。ICCの結果から、iPS細胞が適切な多能性マーカーの発現パターンを示したことが分かり、これらのiPS細胞が未分化ヒトES細胞に酷似していることが実証された。

ヒト線維芽細胞をstem genを用いてリプログラミングし、iPS細胞を作製する方法について解説しました。ヒトリプログラミング因子レンチウイルスセットを使用しています。この手順を行う際は、いくつかの要因を考慮することが重要です。

第一に、最適な導入効率を達成するために、一次導入ステップにおいて活性ウイルスと標的細胞の比率を調整する必要がある場合があります。第二に、標的細胞の増殖条件が影響を及ぼす可能性があります。健康で増殖性の高い細胞をリプログラミングする方が、よりリプログラミングに適しています。

第三に、異なる細胞数に合わせてプロトコルを修正する場合、目的の細胞数を培養皿の表面積に比例して調整することを推奨します。最後に、最近の研究でヒトiPSコロニーの生存率を高める有用性が示されているため、リプログラミングを確実に成功させるために Y 2 7 6 3 2 などのROCK阻害剤の使用を検討すべきです。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。