GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

本手順の全体的な目的は、GFPレポーターシステムを用い、retrovirusを介したOCT4、SOX2、KLF4、およびc-MYCの過剰発現により、ヒトiPS細胞を作製することです。まず、適切な量の個々のGFP発現retrovirusを添加します。次に、GFP発現ウイルスに感染した細胞を、マウス胚性線維芽細胞と共に0.1%ゼラチンコートプレートに転移させます。

手順の第3段階は、培地をヒト胚性幹細胞培養培地に交換することです。最後に、ヒト胚性幹細胞と同様の形態を示すGFPサイレンシングiPSコロニーを単離します。最終的に、免疫蛍光染色およびR-T-Q-P-C-Rを通じて、内因性多能性マーカーの発現が示されます。

多能性表面マーカーを用いたライフスタイル染色や形態学的変化の観察といった既存の手法に対する本手法の主な利点は、望ましいiPS細胞の選別が可能であることです。GFP発現の消失を多能性細胞のマーカーとして用いることで、培養開始のための細胞コロニーを容易に単離できます。感染の1日前に、線維芽細胞用培地を用いてヒト線維芽細胞を培養します。6ウェルプレートの1ウェルに1×10⁵個のヒト線維芽細胞を播種します。翌日、培地を吸引して死細胞を除去し、5 µg/mLのプロタミン硫酸を含む新鮮な線維芽細胞用培地2 mLを添加します。

次に、感染多重度（MOI）が5になるように、各GFP発現ウイルスの適切な量を慎重に添加します。感染1日後、細胞を37°Cで一晩インキュベートします。ウイルス含有上清を除去し、2 mLのPBSで3回洗浄します。

次に、感染から3日後に、線維芽細胞用培地を2 mL加えます。GFP蛍光を確認し、線維芽細胞用培地を2 mL補充します。翌日、0.1% Gelatinでコーティングした10 cm Petri dishに、照射したマウス胚性線維芽細胞またはMEFフィーダー細胞を、線維芽細胞用培地を用いて1 × 10⁴ cells/cm²の密度で播種します。

細胞を37°Cで一晩インキュベートします。翌日、感染させたヒト線維芽細胞を1 mLの0.05%トリプシンEDTAを用いて37°Cで5分間剥離し、200 Gで5分間遠心分離します。細胞を10 mLの線維芽細胞用培地で再懸濁し、0.1%ゼラチンでプレコートしたmfsに細胞を播種します。24時間後。

培地をHESC培養培地で置換し、毎日培地交換を行います。感染後20日から27日でESC様コロニーが出現し始めます。蛍光顕微鏡下でESC様コロニーの出現を確認してください。HSCと類似した形態を示すコロニーにおいて、GFP蛍光が消失していることを確認します。

10 µL ピペットを使用して、個々の iPSC コロニーをピックアップし、ゼラチンおよび meth でコーティングし、HESC 培地を添加した 12 ウェルプレートの 1 ウェルに入れます。培地を毎日交換し、プレートを 1 mL の DMM F 12 で洗浄して細胞を継代します。

次に、0.5 milliliterのコラゲナーゼを加え、37 degrees Celsiusで10分間インキュベートします。細胞をDM A MF 12で2回洗浄します。続いて、2 milliliterの新鮮なHESC培地を加えます。

次に、セルリフターを使用してコロニーを小さく砕き、プレートに残っている細胞を回収します。再懸濁したコロニーの断片を、ゼラチンとMEFでコーティングした6ウェルプレートの1ウェルに移し、37 °Cで2日間インキュベートします。

免疫蛍光染色により細胞を確認します。PBSで3回洗浄し、室温で4%パラアルデヒドを用いて20分間固定します。細胞をPBSで緩やかに3回洗浄し、0.2% Triton X-100含有PBSで30分間透過処理を行います。

PBSに含まれる3%BSAを用いて細胞を2時間インキュベートし、非特異的結合をブロックします。次に、一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。その後、細胞をPBSで3回洗浄し、二次抗体とともに室温・暗所にて1時間インキュベートします。

最後の洗浄時に、PBSで細胞を3回洗浄します。DAPIを添加し、室温で5分間インキュベートします。定量的なリアルタイム解析のため、蛍光顕微鏡を用いて細胞をイメージングします。

RNA分離キットを用いて、ヒト線維芽細胞由来のヒトIPCから全RNAを抽出する。逆転写酵素を用いて第1ストランドcDNAを合成する。

次に、これをテンプレートとしてQPCRを行い、多能性遺伝子を検出します。OCT4、SOX2、KLF4、およびc-Mycを搭載したレトロウイルス・カクテルを導入したヒト線維芽細胞（BJ細胞）について、ここではリプログラミング5日目から観察された形態的変化を示しています。10日、14日、21日目にかけて、細胞は21日後にhESC様の形態を示し始め、iPSCsはGFP蛍光によって認識されます。

ESCやiPS細胞などの多能性幹細胞は、プロウイルス遺伝子の発現を抑制するための分子機構を発現しています。しかし、本手法で使用するレトロウイルスベクターは、レトロウイルスLTRによってリプログラミング遺伝子と共にGFPを発現します。したがって、GFPを持続的に発現している細胞は、プロウイルス遺伝子サイレンシングが起こらずに外来遺伝子を発現していると考えられます。一方で、多能性分子ネットワークを獲得し、正確にリプログラミングされたiPS細胞コロニーでは、GFPの発現が消失します。

この図は、TRA 180 1、TRA one 60、SSEA four、T four、およびnanoに対する抗体を用いたDetroit 5 51線維芽細胞由来コロニーの免疫組織化学分析の結果を示しており、正常にリプログラミングされたiPCがこれらすべてのマーカーを発現していることがわかります。さらに、定量RT-PCRを用いて遺伝子発現を解析したところ、T four、SOX two、KLF four M、およびnanoの発現が、親細胞である線維芽細胞と比較して有意に増加しており、H nine HSCと同等であることが明らかになりました。

このビデオを視聴することで、ウイルスの感染方法、および蛍光顕微鏡を用いて完全にlipプログラミングされたIPA細胞を同定し、ピックアップする方法について十分に理解することができます。