大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

このビデオ論文では、レトロウイルスベクターを用いてヒト成人の線維芽細胞をリプログラミングし、多能性幹細胞を作製します。まず、転写因子T three four、SOX two、KLF four、およびcmicをコードするレトロウイルスベクターをヒト線維芽細胞に導入（トランスダクション）します。

感染させた線維芽細胞を、マウス胚性フィーダー細胞上で14〜28日間培養します。得られた培養物をTRA 180 1抗体で染色し、リプログラミングされた細胞のコロニーを同定します。陽性コロニーを、増殖させるためにMEFを含むプレートに移植します。

免疫細胞化学染色は、多能性マーカーの発現および多能性幹細胞株の樹立を確認するために行われます。その後、これらの細胞株をさらに詳細に特性解析するための追加研究を実施する必要があります。一般的に、体細胞リプログラミングやヒト人工多能性幹細胞（iPSC）培養に不慣れな方は、適切なiPSCコロニーを同定することが困難であるため、苦労することがあります。

本手順の実演は、当研究室のポストドクターであるSula Pollak博士が行います。まず、Phoenix AM FO細胞を、10 cmプレートあたり約700万〜800万個の密度で、10 mLの高グルコースDMEMを用いて播種し、インキュベーター内で一晩培養します。翌日、T34SOX、2klf、4cmic、またはGFP遺伝子をコードするベクター12 µgとFuGENE 6 35 µLを含むトランスフェクションミックスを、L-グルタミン含有の無血清高グルコースDMEMで全量を500 µLとして調製します。

混合物を20分間インキュベートします。次に、Phoenix細胞にトランスフェクションさせるため、コンフルエンシーが70〜80%に達したPhoenix細胞を含むプレートに、DNA複合体を緩やかにピペッティングします。6〜8時間後、細胞を37 °Cでインキュベートします。

培地を吸引して除去し、抗生物質を含む高グルコースDMEM 8 mLに交換します。その後、プレートをインキュベーターに戻し、12時間インキュベートします。ピペットを用いて、ウイルスを含む培地を吸引し回収します。

その後、培地を交換し、培地の回収が4回完了するまで12時間ごとにこの操作を繰り返します。回収した培地は4 °Cで保存してください。すべての培地を回収した後、全量を合わせてから、0.45 µmのチューブトップフィルターを用いて50 mLコニカルチューブにろ過し、剥離細胞やデブリを除去します。

ウイルス粒子を含むろ過済み培地は、感染活性を維持したまま冷蔵庫で2週間保存可能です。凍結は推奨されません。導入操作の前日に、凍結保存した成人ヒト線維芽細胞を融解し、ゼラチンコートした6ウェルプレートの各ウェルに 1×10⁵ cells を分注します。

翌日、50 milliliterのコニカルチューブに、T four SOX two、klf four、およびcmic viral mediumをそれぞれ3.5 millilitersずつ混合し、コントロールとしてpoly brainを最終濃度6 micrograms per literとなるように添加します。GFP viral medium 1 milliliter、culture medium 3 milliliters、および最終濃度6 micrograms per milliliterのpoly brainを調製します。ヒト線維芽細胞を含むプレートから培地を吸引します。

次に、4 mLの混合ウイルス培地またはコントロール培地を加え、プレートを1600 Gで1時間、20 °Cで遠心分離します。遠心分離後、プレートを約12時間インキュベートします。その後、ウイルス培地を線維芽細胞培養培地に交換し、さらに12時間インキュベートします。

感染から線維芽細胞培地での培養までのこのプロセスを、最後の感染後、さらに2回繰り返します。線維芽細胞をDMEMで48時間培養します。その後、GFPレトロウイルス培地を用いて、並行して行った導入の感染効率を確認します。

次に、体細胞から多能性幹細胞へのリプログラミングを開始します。感染させた線維芽細胞をヒト胚性幹細胞培地（HES培地）で培養します。または、ゼラチン処理した6ウェルプレートに、マウス胚性線維芽細胞（MEF）を1ウェルあたり約2×10⁵ cellsの密度で線維芽細胞増殖培地を用いて播種し、翌日に培養します。

0.05% trypsin EDTAを用いて感染させたヒト線維芽細胞を分散させ、線維芽細胞増殖培地を用いて1ウェルあたり約1.2×10⁴個の密度で播種します。翌日、リプログラミングの最初の7日間は、0.5 mM酪酸ナトリウムを含むHES培地に交換します。

培地を毎日交換します。培地を酪酸ナトリウムを含まないHES培地に交換し、さらに7〜21日間リプログラミングを継続します。その後も毎日培地を交換してください。

導入された細胞に形態学的変化があるか確認します。導入した線維芽細胞をフィーダー細胞上に移植して約10日後に、細胞コロニーが出現し始めます。再プログラミングされた細胞を含むこれらのコロニーは、ヒト人工多能性幹細胞またはヒトIPS細胞と呼ばれます。

ヒトiPS細胞コロニーは、MEFフィーダー細胞上に播種してから14〜28日で単離可能な状態になります。この段階で、ヒトiPS細胞コロニーをMEF含有プレートまたはMatrigelコートプレートのいずれかに移植することができます。ここでは、ヒトiPS細胞コロニーをピックアップする前日に、MEF含有プレートへの移植を行う方法を示します。ガンマ線照射したMEFフィーダー細胞を含む24ウェルプレートを、線維芽細胞増殖培地で播種します。

ヒトiPS細胞コロニーをピックアップする日に、37°C、5%CO2条件下でインキュベートします。MEFから線維芽細胞増殖培地を吸引し、PBSで洗浄してFBSの残留物を除去します。続いて、10 µMのROCK阻害剤Y 2 7 6 3 2を含むヒト胚性幹細胞（HES）培地を各ウェルに0.5 mLずつ加えます。次に、ラミナーフローフード内に設置した顕微鏡を用いて、リプログラミングプレート内のヒトiPS細胞コロニーの形成を確認します。

必要に応じて、21ゲージの針を用いてヒトiPS細胞コロニー周囲の線維芽細胞を除去します。プレートをPBSで洗浄し、TRA 180 1生細胞特異的抗体を含む新鮮なHES培地を加えます。細胞を37°C、5% CO2のインキュベーターに戻します。

30分後、培地を10 micromolarのrock inhibitorを添加した新鮮なHES培地と交換します。その後、蛍光顕微鏡でコロニーを観察してください。TRA-1など陽性のコロニーを1から81までマークします。

21ゲージの針を客観的なマーカーとして使用します。TRA 180 1陽性のヒトiPS細胞コロニーを数個の小さな断片に切り分けます。次に、オートピペットを用いて、ヒトiPS細胞コロニーの断片をMEFの入った24ウェルプレートの各ウェルに転送します。iPS細胞以外の細胞を転送しないように注意してください。

プレートをインキュベーターに入れ、ヒトiPS細胞コロニーを24～36時間付着させ、培地を毎日交換します。24ウェルプレートへの初回播種から48時間後には、正しいHE様形態を持つヒトiPS細胞コロニーが確認できます。6～8日ごとに、21ゲージのニードルで切断することにより、ヒトiPS細胞コロニーを手動で継代します。クローン増殖後、12ウェルプレート、次いで6ウェルプレートへと培養規模を拡大します。

ヒトiPS細胞株を樹立した後、免疫染色を用いて多能性マーカーであるTRA-1-60、SSEA-4、T/OCT3/4、SOX2、およびnanogの発現を解析します。詳細な特性解析には、in vitroおよびin vivoでの分化能解析、核型分析、導入遺伝子のサイレンシング解析、メチル化研究、および遺伝子発現解析が含まれる場合があります。

ウイルス導入の効率を判断し、リプログラミングを成功させるためには、レトロウイルス含有培地を用いた効率的な導入が極めて重要です。Friedrichs ataxia患者由来のヒト成人線維芽細胞を用い、GFPレトロウイルス培地で2回連続して感染させた様子を観察しました。線維芽細胞をウイルス培地で単純にインキュベートして感染させた場合、導入された細胞は20%未満でした。しかし、GFPレトロウイルス培地の添加直後に処置を行うことで、導入効率が劇的に向上しました。

単離したヒトiPS細胞コロニーの初期特性評価を行うため、ここでは80%以上の細胞を導入しました。ヒトES細胞に特徴的な多能性マーカーの発現を、ここに示すように免疫化学的に評価しました。単離したヒトiPS細胞コロニーは、多能性マーカーに対して陽性でした。

T 3/4、SOX 2、nano SSEA 4、および TRA 1 60 のDNA共染色において、上段のパネルに示されているDPI染色は、ヒトiPS細胞コロニーとフィーダー細胞の両方で検出されました。これらの結果は、本リプログラミングプロトコルを用いて得られたヒトiPS細胞が、未分化なヒト多能性幹細胞に特徴的な適切な多能性マーカーを発現していることを示しています。

このビデオを視聴することで、レトロウイルス導入を用いてヒト線維芽細胞を多能性幹細胞へ正常に初期化し、正しく誘導されたヒト人工多能性幹細胞コロニーを同定し、hiPSCの初期特性解析を行う方法について十分に理解することができます。