ヘッドオンRNAポリメラーゼによって停止した複製フォークの再起動を指示する

この手順の全体的な目的は、正面衝突後のRepli zoneおよびRNAポリメラーゼ（RNAP）の運命を観察することである。まず、ビオチン化DNA上で転写複合体を構築し、それをStrippタブレットおよびビーズ上に固定することで、RNAP伸長複合体を停止させる。次に、このRNAP伸長複合体に事前に準備したフォーク状DNAをライゲーションし、正面衝突するRNAPの下流に複製フォークを形成させる。

手順の第3ステップは、repli zoneを構築し、複製フォークにおいてリーディング鎖の合成を開始することです。手順の最終ステップは、磁気ビーズからDNAを回収し、PCR精製カラムを用いてDNAを精製することです。最終的に、精製した放射標識DNA産物のアルカリアガロースゲル電気泳動を通じて、rosoが正面衝突型の転写複合体に衝突して停止することを示す結果を得ることができます。

こんにちは。ロックフェラー大学のMike O'Donnell研究室のリチャード・ポメランスです。本日は、固相におけるリボソームとRNAポリメラーゼの正面衝突を再現する手順をご紹介します。当研究室では、DNA上の転写複合体が複製プロセスにどのような影響を与えるかを研究するために、この手法を用いています。

それでは始めましょう。このプロトコールの最初の手順として、T7 A1プロモーターを含むビオチン化された3.6 KB DNAテンプレートとRNAPホロ酵素を、100 µLのバッファーA中で混合し、この混合液を37 °Cで10分間インキュベートします。10分間のインキュベーション後、リボヌクレオチドのアデノシン三リン酸、シチジン三リン酸、およびウリジン三リン酸を添加します。これにより、RNA合成を20ヌクレオチドに制限します。

停止したRN ape伸長複合体をビーズ上に固定するため、溶液を37 °Cでさらに10分間インキュベートします。この溶液をストレプトアビジンコート磁気ビーズに加えます。混合物を室温で10分間インキュベートしてください。

0.9 mLの高塩濃度バッファーでビーズを洗浄し、固定化された停止RNAP伸長複合体を精製します。各洗浄後、磁気分離により上清を除去して、非特異的なR-N-A-P-D-N-A複合体を取り除きます。この洗浄を5回繰り返してください。

次に、ビーズを0.9 millilitersのバッファーAでさらに2回洗浄します。最終洗浄後、停止したRNAP伸長複合体に結合したビーズを、100 microlitersのNew England Biolabsバッファー4に懸濁させ、マグネットストリップで回収して、RNAPのヘッドオン方向の下流に複製フォークを構築します。次に、10 unitsのシュリンプアルカリホスファターゼ（SAP）を添加し、サンプルを37 degrees Celsiusで10分間インキュベートします。ビーズを0.9 millilitersのバッファーAで3回洗浄します。その後、ビーズを50 microlitersのQuick T4ライゲーション反応バッファーに再懸濁します。

2 µLのQuick T4 ligaseとpre-need forked DNAを加え、室温で10分間インキュベートします。最後に、0.9 mLのバッファーAでビーズをさらに3回洗浄し、停止したRNAP伸長複合体および下流の複製フォークに結合した磁性Strep Aビーズに、ヘキサマーDNAヘリカーゼを混合します。この溶液を150 µLのバッファーAで調製し、23 °Cで30秒間インキュベートします。

23°Cでの短時間の32回目インキュベーションの後、polymerase three beta clamp、A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P、α-P³²標識dGTPおよびα-P³²標識dATPを加え、全量を200 µLにします。サンプルを37°Cで5分間インキュベートします。

単鎖DNA結合タンパク質、DCTP、およびDTTPを添加して複製を開始します。また、$\alpha$-$^{32}$P標識DTTPおよびDCTPを加え、最終容量を250 µLにします。10分後、0.5 M EDTAを12 µL添加して反応を停止させます。

次に、stC-dinビーズを沸騰させ、ビーズからDNAを放出させます。50 °Cで30分間プロテイナーゼKで処理し、残留DNAを除去します。再度ビーズを沸騰させ、磁気分離によって上清を除去します。

Kyogen PCR cleanup kitを用いて、DNAを含む回収した上清を精製します。最後に、精製した放射標識DNA産物をアルカリアガロースゲルで分析します。通常、複製フォークがRNAPに正面衝突すると、2.5 KBおよび3.6 KBの長さの2つの産物が生成されます。2.5 KBの産物は、フォークから停止したRNAPまでのDNAの長さを表しています。

これは、RNAPとの衝突によりレプリソームが停止した結果生じます。3.6 KBの産物はフルレングスのDNAであり、RNAPによるプロモーターの占有が不完全であるか、あるいは前方衝突したRNAPをレプリソームが部分的に読み飛ばした結果生じます。良好な結果では、約50%のフルレングスDNAが生成されます。

しかし、場合によっては、RNAPによるプロモーターの占有率が低下し、フルレングスのDNAの割合が高くなることがあります。これは、停止したRNAPが存在しない場合、より多くのレプリケーションゾーンがRNAPとの正面衝突を起こさず、結果としてフルレングスのDNAのみが得られるためです。ここでは、DNAに結合した停止状態のRNAポリメラーゼ伸長複合体が存在する場合に、レプリケーションおよび固相法を行う方法について説明しました。この手順を行う際は、DNAに非特異的に結合してレプリケーションを阻害する過剰なRNAポリメラーゼを除去するため、停止した転写複合体を高塩濃度で洗浄することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っております。