T波イオンモビリティー質量分析：タンパク質複合体解析のための基本的な実験手順

本実験の全般的な目的は、タンパク質複合体の全体的な形状を決定することです。これは、タンパク質複合体イオンの質量分析イオンモビリティデータを取得し、各電荷状態のドリフト時間を測定することによって達成されます。第2ステップとして、天然のタンパク質構造のモビリティ測定を確実にするため、実験条件の妥当性を検証します。

次に、測定されたドリフト時間の値を衝突断面積に相関させます。この結果により、三次元構造が未知であるタンパク質またはタンパク質複合体の衝突断面積が決定されます。これらの情報は、それらの全体の形状、サブユニットのパッキング、およびトポロジーに関する手がかりとなります。

こんにちは。私はワイズマン科学研究所、生物化学部門のMicラボのアイザック・レスキです。そして、同じくMicラボのナーム・キルシェンバウムです。今日は、ハイブリッド質量分析計とイオンモビリティ計を用いて、タンパク質複合体の衝突断面積を測定する手順をご紹介します。私たちは研究室でこの手法を用いて、タンパク質複合体の全体的な形状や構造的な組織化を研究しています。

それでは始めましょう。この手順では、タンパク質複合体のイオン移動度質量分析、すなわちIMM MS分析に焦点を当てます。試料調製ステップ、装置のキャリブレーション、およびMSおよびタンデムMSの最適化手順については、関連するJOプロトコルで解説されています。

一般的に、このプロトコルでは、酢酸アンモニウムなどの揮発性バッファーを用いた、低マイクロモル濃度の錯体を使用します。ナノフローキャピラリー1本あたり1～2 µLが消費されるため、MS条件の最適化を可能にするため、最小量として10～20 µLを調製してください。本手順を開始するには、トラベリングウェーブ（T-Wave）Synap IM-MSを以下の動作モードに設定します。まず、IM（イオンモビリティ）および飛行時間（TOF）によるイオン分離の両方について、TriWaveおよび圧力が自動的に設定される「Mobility TOF」モードを選択します。次に、正イオン検出（Positive ion acquisition）およびVモードに設定し、フライトチューブと反射板を通るイオンの経路を設定します。ここで、すべてのガスをオンにしてください。

IM分離には窒素を、トラップ領域および転送領域にはアルゴンを使用します。推奨される初期値は、IMS装置のガス流量を 24 milliliters per minute、トラップ領域の流量を 1.5 milliliters per minute とします。次に、未知のタンパク質複合体に合わせて質量電荷比の取得範囲を設定します。

最初は広い質量範囲を使用し、その後、目的の値まで範囲を狭め、それに合わせてMSプロファイルを調整します。巨大複合体の透過効率を最大にするには、検出質量範囲を 1030 2000 m/z に設定し、MSプロファイルをオートに設定してください。それ以外の場合は、提示されたチャートに従ってプロファイルを設定できます。

RF設定を確認し、必要に応じて、図に示すように大きなタンパク質複合体に適切な値に調整してください。次に、サンプルをロードし、キャピラリー電圧と低ナノフロー圧を印加します。スプレーが開始されたら、ナノフロー圧を最小値まで下げて調整してください。

さらに、コーンに対するキャピラリーの位置を調整し、十分な分解能のMSスペクトルを取得できるようにMS収集パラメータを調整します。また、関連するJoVEプロトコルに詳しく記載されている通り、装置全体およびサンプリングコーンに沿った圧力勾配、ならびに抽出コーンバイアストラップおよびトランスファーの電位設定を最適化します。これらのパラメータはサンプルによって異なりますが、ここではペプチドからタンパク質複合体まで、さまざまな鉄質量のMSスペクトルを収集するために使用した条件を示します。

大きなイオンには、より高い衝突エネルギーとバイアス電圧が必要です。また、巨大なタンパク質複合体の解析においては、複合体の活性化を最小限に抑えるために、バックプレッシャーを上げることを推奨します。ピークの位置が変わらない範囲で、サンプルコーン抽出電圧、コーントラップ電圧、およびバイアス電圧を、約10 Vずつ段階的に下げて調整してください。

最適なマススペクトルが得られた後、タンパク質複合体を分析する場合は、ドリフト時間またはIMプロファイルを調整する必要があります。質量測定と移動度測定の両方にとって最適な条件は、しばしば相反します。したがって、これら2つの適切なバランスを取ることが重要です。

全体として、ピークがドリフト時間範囲全体に分布し、ピークプロファイルが滑らかになるように、鉄のモビリティプロットを最適化する必要があります。ガウス分布に近づくにつれ、顕著なピークの非対称性は、複数のコンフォメーションの分離不十分に関連している可能性があります。モビリティ分離を最適化するために、T-wave速度、T-wave高さ、およびIMSガス流量を調整できます。T-wave速度を上げると、ドリフト時間分布プロファイルが広がります。

T-waveの高さの値を上げると同様に裾野が狭まりますが、IMSのガス流量を最低10 milliliters per minuteから段階的に増やすと、ドリフト時間プロファイルはより高い値へとシフトします。これにより、イオン移動度スペクトルを最適化します。3つの変数のうち2つを固定して3つ目を最適化するため、T-waveの速度を250 meters per secondに、ガス流量を24 milliliters per minuteに設定します。次に、開始点として高さを3 voltsに設定し、1 volt刻みで段階的に増加させます。

高いバイアス電圧を使用する場合、IMSガス圧を下げてバイアス電圧を低減させることが推奨されます。これにより、複雑な活性化や解離を抑制することができます。条件が最適化されていない場合、ドリフト時間スペクトルの前半部分と後端部分に同一のピークが観察される「ロールオーバー効果」が現れることがあります。

イオンがIAMデバイスを通過しない場合、実質的にその移動時間が、次のイオンパケットがモビリティセルに放出されるまでに必要な時間よりも長くなる可能性があります。その結果、前のパケットがプッシャー領域に届く前に、トラップ領域から新しいイオンの束が放出されます。このアーティファクトを解消するには、T-waveの高さを上げ、T-waveの速度およびIMS圧力を下げてください。

さらに、トラップの放出時間は調整可能です。また、トランスファーT波の高さが少なくとも5 Vに設定されていることを確認することが重要です。これは、IMSセルへのイオン漏出を防ぐためでもあります。

モビリティトラップの高さは最大レベルに維持してください。転送T波の速度が低く、振幅が高い場合、ドリフト時間分布プロファイルにリップル（波打ち）が生じる可能性があります。このアーティファクトは、プッシュ周波数と転送T波速度の間の部分的な同期により、転送領域およびタフ領域を通じてイオンのモビリティ分離が維持されない場合に発生します。

この影響を排除するには、プッシャー時間または転送T波速度のいずれかを調整する必要があります。プッシャー周波数は質量範囲に関連しているため、このパラメータを変更すると、このアーティファクトが再発する可能性があります。

T波の高さが及ぼす影響はわずかです。ただし、T波を低減させることでリップルの除去に寄与する場合もあります。前述のパラメータを最適化すれば、高分解能なIMMSデータを取得することが可能です。

MS.Peaksタンパク質複合体は、残留水や緩衝液成分の除去を促進するために、質量分析計内で活性化されることがよくあります。しかし、活性化エネルギーがしきい値を超えて増加すると、部分的な展開が起こり、複数の中間状態が形成される可能性があり、これらは天然の溶液状態の構造に対応しているとは考えにくいです。その結果、展開した構造の不均一な集団を反映して、ドリフト時間のピークがシフトし、幅が広がることがあります。

溶液相の構造と一致するドリフト時間データを得るためには、IM分離前にイオンを加速させる電圧を慎重に制御することが不可欠です。そのため、ドリフト時間スペクトルへの影響をモニタリングしながら、キャピラリー電圧とコーン電圧を段階的に上昇させます。さらに、高いMS分解能を得るには、トラップ電圧よりもトランスファー電圧を上げる方が好ましいです。IMデバイスは、トランスファー領域とTOFアナライザーの前に配置されています。

活性化はIM測定の後に行われるため、IMへの影響はありません。一方で、複合体の天然構造を維持した条件下でデータ収集が行われることを確実にするために、MSの精度を高めることができます。そのため、単一の最適化されたパラメータセットに従うのではなく、広範囲の実験条件および溶液条件でデータを収集することが重要です。以上の理由から、トラップ衝突電圧を段階的に上昇させ、イオン移動度プロファイルへの影響をモニタリングしながら10 volt間隔でデータを取得してください。最後に、アンフォールド（変性）した構造を特定し、取得したデータを評価するために、サンプルにpH 2から7の範囲で酢酸を滴定してタンパク質複合体の解離を手動で誘導し、データを記録します。その後、既知の断面積値を持つキャリブレーションタンパク質を用いたドリフト時間校正法によって定義される断面積を用いて、T-wave IMSシステムでデータを解析してください。

まず、各10 µMの変性キャリブレーションタンパク質溶液を調製します。馬のシトクロムC、馬心筋ミオグロビン、およびウシウビキチンを、水：メタノール：酢酸＝49：49：0.2の容量比で混合して使用してください。次に、ターゲットタンパク質またはタンパク質複合体に用いたのと全く同じ装置条件下で、キャリブレーションタンパク質のIMMSデータを取得します。IM分離設定を維持するため、すべての電圧および圧力値を同一に保ってください。

データを取得後、各電荷における実験的なドリフト時間の値を抽出します。校正ドリフト時間 T prime D を以下の式を用いて補正します。ここで、MOVZ は観測されたイオンの主電荷比であり、C は強化デューティサイクル（EDC）遅延係数です。C の値は通常 1.4 から 1.6 の間であり、装置によって異なります。

EDC値は、System Oneのデータ収集設定の「One Acquisition Setup」タブに表示されます。鉄の電荷状態と換算質量を用いて、各キャリブレーション断面積を補正します。ここで、$\omega_C$は補正後の断面積、$\omega$は文献値の断面積、$Z$は鉄の電荷状態、$M$はケージイオンの分子量、$MG$は鉄の分子量です。

背景ガス（通常は窒素）を用い、T'Dに対してωCをプロットします。得られた曲線は次の方程式に対応します。パラメータXおよびAは、プロットを線形関係にフィッティングさせることで抽出できます。傾きXは指数比例係りに対応し、Aはフィッティングによって決定された定数を表します。

適合相関係数R²を算出します。R²の許容値は0.95より大きい値です。相関係数が低い場合は、タンパク質のアンフォールディングが不完全であることや、サンプルの経時劣化が原因である可能性があります。

異なるキャリバータンパク質に用いられた実験条件の相違、スペクトルのノイズ、不完全なデータ処理、または計算ミスが原因であると考えられます。決定した指数係数 X を用いて ca ドリフト時間を補正し、omega C 対 T prime D を再プロットすることで計算結果を検証してください。相関係数を再度定義します。前述の手順と同様に、0.95 より高い値が期待されます。同様に、標的タンパク質またはタンパク質複合体の測定ドリフト時間を補正し、算出された指数係数 X を用いて標的タンパク質またはタンパク質複合体のドリフト時間を校正してください。フィッティングにより決定された定数 A を用いて、omega が a TD と等しくなるように、標的タンパク質またはタンパク質複合体の omega を算出します。これらの手順を各実験条件に対して繰り返してください。

未知のタンパク質またはタンパク質複合体の衝突断面積を定義する場合、各実験を少なくとも3回繰り返し、衝突断面積の値が決定した後に、これら3回の測定値の標準偏差を算出することを推奨します。複合体のトポロジーや配置を予測するために、モデリングアプローチが用いられます。これは、実験的に得られた衝突断面積の値と、生成されたモデル構造全体から算出されたin silico Omega値をフィッティングさせることで行われます。全般的に、この分野はまだ初期段階にあり、このアプローチを汎用的にし、幅広い複合体に適用できるようにするためにはさらなる発展が必要です。

ウシヘモグロビンの四量体形態の表面表示をここに示します。酸素輸送体であるヘモグロビン複合体は、上述のアプローチの例として適しています。ヘモグロビンは2つのαサブユニットと2つのβサブユニット（それぞれ青色と赤色で表示）からなる四量体タンパク質複合体であり、αβダイマーのさらなる二量体を形成しています。

ヘモグロビンのIMMSスペクトルをここに示します。得られた複合体のIM msスペクトルでは、完全な複合体に対応する主要な電荷系列分布と、αβ二量体およびα・βモノマーサブユニットの質量に一致する副次的な電荷系列が認められます。ヘモグロビンのさまざまな形態における理論的および実測のCCSをここに示します。

二量体および四量体形態の複数の電荷状態で得られたドリフト時間を用いて、オメガ値を算出した。これらを理論値と比較した。四量体複合体には、環状、二面角状、または鎖状パッキングの3つの会合の可能性があるためである。

二量体から四量体へ移行した際のomegaの増加量を算出することで、構造的な組織化を予測することができます。先行研究および我々の実験により、測定されたccssと結晶構造データから導出されたタンパク質表面積との間に強い相関があることが示されています。この相関を利用して、異なるパッキング形態における二量体に対する四量体の予想表面積増加量を算出することが可能です。

これは、各サブユニットを非球形物体として考慮することで行われます。鎖状の assembly の場合は、テトラマーの CCS が約2倍に増加しますが、C4 または D2 パッキングの場合は、それぞれ約1.5倍および1.67倍の増加となります。ヘモグロビンのテトラマー形態と DME 形態の測定 CCS 値の間で計算された比率は、1.57 ± 0.03 でした。

この数値は、天然構造が線形に組織化されているのではなく、環状または二量体テトラマーとして、よりコンパクトな形態で配置されていることを示しています。ヘモグロビンの解析済み結晶構造で同様の計算を繰り返したところ、テトラマー形態とDME形態の表面積比は1.63となり、これはD2対称性に適合しました。明らかに、この幾何学的モデルは簡略化されており、タンパク質サブユニットは単なる球体ではありません。

しかしながら、この計算は、高分解能構造が未知である複合体のパッキングを明らかにする上で、IMMSが持つ刺激的な可能性を証明しています。ここでは、タンパク質およびタンパク質複合体のドリフト時間を測定する方法と、それらの衝突断面積（CCS）値を算出する方法について説明しました。この手順を行う際は、校正用タンパク質のIMMSデータを、標的タンパク質またはタンパク質複合体に用いたのと全く同じ条件下で取得することが重要です。

さらに、これらの実験を少なくとも3回繰り返し、3回の測定値の標準偏差を算出することを強く推奨します。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。