がくからパッチクランプの静電容量の録音のための方法

こんにちは、ケン・パラディソです。私はベセスダキャンパスのNIHにある国立神経疾患・脳卒中研究所（NINDS）のイントラムラルプログラムで、Ling Gang Wuの下で研究しています。今回は、calyx-type終末のシナプス前記録パッチクランプ法について解説します。

脳組織を調製するため、ラットから脳を摘出します。脳をこの溶液（氷冷した低カルシウム溶液）に入れ、常に脳に酸素が供給されるよう、カルボゲンでバブリングさせます。また、損傷を最小限に抑えるため、溶液は氷冷状態でなければなりません。

これで脳がこの溶液に浸かった状態になります。脳を取り出し、ブロックに固定できるよう適切にカットし、Sano correlateまたは瞬間接着剤を用いてブロックに固定します。その後、チャンバーに氷冷した低カルシウム溶液を満たしてバブリングを行い、バイブレーターに設置します。そして、ブレード周波数 70 hertz、前進速度 0.01 to 0.02 millimeters per second（つまり 10 to 20 microns per second）で、厚さ 180 to 190 microns のスライスを作成します。

各切片を作成後、氷冷生理食塩水から、通常のカルシウム溶液が入ったこのチャンバーに切片を移します。これは記録に使用する溶液と同じものであり、生理的な温度である37°Cに設定されています。その後、回復させるために切片をここに静置します。

生理学実験を行う前に、ここへ30分から1時間ほど浸しておきます。では、脳を溶液から取り出します。ここでは、デモンストレーションのために大きめの脳を使用しています。

これは出生後20日のラットの個体です。これを裏返します。私たちが注目しているのは脳幹です。

このように、この下の領域と萼（がく）の部分がこのあたりの領域で保持されています。そこで、脳の残りの部分を切り離して脳幹を単離し、その後、脳幹をスライスチャンバー用に準備します。では、脳幹だけを単離するために、脳の残りの部分を切り離していきます。

現在の状況を示すために、個体を裏返します。通常はこの方法では行いませんし、繰り返しますが、この部分は後ですべて取り除くことができます。再び表に返すと、脳幹が単離されていますので、ちょうどその位置でさらにもう一度切断します。

はい、以上です。これが脳幹です。ホルドの杯状終末（Calyx of Held）はそのあたりと、こちらにあります。

これが脳幹です。ここでも、少し後ろに押し込みます。小脳の片側を切除することで、脳幹をこのように横向きに固定することができます。

Sanoアクリル接着剤を少量入れ、横向きに寝かせたまま、冷たい氷と低カルシウム溶液で素早く満たします。できるだけ早く酸素ラインを挿入してください。その後、それを持ち上げてバイブレーターへ移動させます。

脳の端に到達するまでは速く進め、端に到達した後は速度を0.01 millimeters per secondまで下げます。つまり10 µm/sであり、極めて低速で移動させることになります。

脳の最初の部位はmtb、すなわち台形体正中核を持つ部分です。そこには、さて、転送ピペットに入れたら、できるだけピペットの先端に近づけるようにします。ここに脳のスライスがあり、これを、通常のカルシウム濃度で温度を高めに設定した標準的な記録溶液が入ったチャンバーへと速やかに転送します。

これにより、スライスは切断手順後の回復が可能となり、生理学実験に使用できる状態になります。それでは、ここからは同様の手順を繰り返します。パッチクランプを行うために、以下の装置を使用します。

固定ステージ搭載の正立顕微鏡を使用します。述べた通りステージは固定されているため、マニピュレーターを用いて顕微鏡本体をその下で移動させます。ステージの保持にはWigs and Newman社製のマイクロマニピュレーターを使用し、アンプのヘッドステージにはHEKA社製のEPC 10パッチクランプアンプを使用しています。

また、言及しておくべき点として、我々は赤外光を用いたDIC（微分干渉コントラスト法）を使用しています。ここにIRカメラを設置しており、CAEを探している間、見えているものはすべて画面上に表示されます。パッチクランプアンプは、同じくHEKA社製のPulseというソフトウェアで制御されており、このソフトでアンプおよび生理学実験のすべてを制御します。

結果はこの画面に表示されます。保持しているカルックスは大きなシナプス前終末であり、その大きいために終末への物理的なパッチクランプが可能です。これにより、特に中枢神経系（CNS）においてはユニークな手法である、シナプス前記録を行うことができます。

これにより、シナプス前で活性化されたカルシウムチャネルを測定することが可能になります。また、calyxに至る神経を刺激したい場合には、活動電位の活性を測定することもできます。この研究室では、神経伝達物質を含む小胞が膜と融合するエキソサイトーシスと呼ばれるプロセスを測定しています。

次に、これらの小胞がエキソサイトーシスと呼ばれる過程で膜と融合すると、シナプス末端に膜が追加され、それを容量の変化として測定することができます。末端に膜が追加されるため、容量は増加します。したがって、本日ご紹介する実験は、膜が除去される際のシナプス前部の容量測定です。膜を追加し続けることはできないため、当然、一部を除去する必要があります。

そのプロセスはエンドサイトーシスまたは膜取り込みと呼ばれます。これも測定することが可能であり、容量レベルの低下として測定されます。その例については後で示します。これにより、カルシウムチャネルの活性をモニタリングできるだけでなく、エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスに関与するいくつかのタンパク質をモニタリングし、研究することが可能になります。

ペプチドなどを添加することで、開口放出（エキソサイトーシス）または内飲作用（エンドサイトーシス）に関与するタンパク質を阻害させることができます。また、同様の効果を持つ毒素を使用することも可能です。さらに、末端へのカルシウム流入量を調節することで、開口放出のプロセスや神経伝達物質の放出、およびそれに続く膜の取り込みについて詳細に研究することができます。

こちらは細胞内記録液が入ったチューブです。あらかじめ準備して冷凍保存しておき、通常は数週間から1ヶ月程度まで使用可能ですが、その後は新しい溶液を作成する必要があります。記録を行う直前に、チューブ内に混入したほこりやその他の不純物を除去することが重要です。

方法は2通りあります。溶液を取り出してろ過するか、あるいは1〜2分間遠心分離を行い、その後溶液を回収して、デブリやその他の物質が含まれる底部の画分を残す方法です。私は遠心分離する方法を好むため、今からそれを行います。

こちらが細胞内液の入ったチューブです。解凍済みです。これを小型遠心機で2〜3分間遠心分離します。これにより、溶液中の大きな塵などの粒子を取り除くことができます。

それでは、今遠心分離した上清を、撹拌しないように注意しながら、清潔なチューブに移します。全体の約90%を採取し、最後のわずかな部分は採取しないようにします。ちょうどこのあたりで止めます。

実験中に十分に冷えた状態を維持するため、これをすぐに氷上に置きます。これは非常に重要です。こちらは、私たちが使用しているピペットの一つです。

これは細胞内記録に使用します。外径2 mm、内径1.16 mmの厚壁ボアシリカガラス製です。まず、ピペットのバックフィルを行います。

吸引を行い、ピペットを記録液に入れ、吸引をかけてピペットの先端の極めて狭い部分を満たします。この部分は、他の方法では充填することができません。その後、キャピラリーチューブを用いて、ピペットの背面から電極の残りの部分を充填します。これは生理学における標準的な手法であり、文字通りピペットを軽く弾いて行います。

ピペットの先端を破損させる危険がありますが、そうしないと気泡が入り込むことがよくあります。それでは、パッチクランプアンプのヘッドステージに接続されたピペットホルダーに装着します。そこには塩化銀線があります。

塩化銀線が細胞内液に接触することで、シナプス前終端における電気活動の測定が可能になります。そこで、CAEが多く含まれるスライスを探します。CAEの高密度な領域が必要だからです。

ここでは、台形体内側核（MNTB）を探しています。そこに、calyx appを形成する終末端が存在します。そこで、スライスをスキャンし始めます。例えば、ここに表面から少し深い位置にあるcalyxがありますが、接着させる箇所がほとんどないため、そのままスキャンを続けます。

ここでは、この萼片を標的とします。画面上に2つの印を付けましたが、ここがピペットの進入位置になります。ピペットが下降して、狙いとする萼片の部位に到達するのが分かります。

正圧をかけて萼（がく）を押し上げ、その後、正圧を解除します。すると、萼がピペットに押し付けられます。そのタイミングで非常に緩やかな吸引を行い、膜を吸い上げるか、または膜がピペットチップに密着するようにします。では、正圧を解除します。

それでは、吸引をかけます。ここでは5 mVのパルス、正確には4 mVのパルスを印加しています。はい、これで完了です。

膜電位を-80mVまで下げ、高速過渡電流をキャンセルします。次にホールセル構成にします。緩やかに吸引をかけ、ホールセルへと移行させます。

これらの充電過渡応答は、ピペットと細胞が連続した状態になり、全細胞記録が得られたことを示しています。これも非常にきれいなショットです。ここにある明るい赤色の線が容量トレースであり、急激な跳ね上がりが見られた後、減衰しているのがわかります。

以上で、calyx upheld プレシナプス端子から記録を得るための基本的な手法について説明しました。また、medial nucleus of the trapezoid bodyを含むスライスの作製方法についても解説しました。そこにcalyxes have heldが存在しています。

スライスを観察する手法について説明しました。各スライスを順に確認し、表面に最も多くのcalyが存在するスライスを探します。次に、見つかった中で最大のcaly膜を探し、そこにパッチクランプ記録を行います。

また、パッチクランプ法の技術についても説明しましたが、これらは標準的なパッチクランプ記録の手法です。