ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

本手順の全体的な目的は、プラスミドDNAのアレイライブラリーを用いて酵母細胞を形質転換することです。まず、適切な量の酵母細胞を培養し、次に酢酸リチウムで処理することで、DNA形質転換に対するコンピテント細胞を作成します。

次に、コンピテント細胞とDNAを混合し、形質転換を行います。本手順の最終ステップは、形質転換体の選択および解析です。最終的に、酵母スポットアッセイや顕微鏡観察を通じて、プラスミドDNAが酵母の表現型に及ぼす影響を示す結果を得ることができます。

標準的な酵母形質転換などの既存のプロトコルと比較した本手法の主な利点は、多数の異なるプラスミドを自動化された形式で酵母細胞に形質転換できる点にあります。このハイスループット酵母形質転換プロトコルは96ウェルプレート10枚分を想定して設計されていますが、必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンが可能です。より大規模な実験を行う場合、成功の鍵はすべてのプレートと試薬を整理して管理することです。

混乱を避けるため、本プロトコルでは実験開始後、Biobot ラピッドプレートリキッドハンドラーを使用します。まず、アレイ酵母プラスミドライブラリ由来のプラズマDNAを、ラウンドボトム96ウェルプレートの各ウェルに 5 ～ 10 µL ずつ分注します。96ウェルプレートをカバーせず、クリーンベンチ内のドラフトフードに入れ、一晩乾燥させます。

次に、500 mLのバッフル付きLin Meyerフラスコに入れ、200 mLの酵母ペプトンデキストロース（YPD）培地にクエリストレインを接種し、30 °Cで振盪しながら一晩インキュベートします。翌朝、最適な増殖を得るため、2 LのYPD培地を用いてクエリストレインをOD 600 = 0.1まで希釈します。別々の2.8 Lバッフル付きフラスコを用いて、1 Lまでの培養液を増殖させます。

培養液のOD 600が0.8から1.0に達するまで、フラスコを30 °Cで4～6時間振盪します。酵母培養液のOD 600が0.8から1.0に達したら、遠心分離により細胞を回収します。使い捨ての225 mLコニカルチューブ4本に培養液を満たし、卓上遠心機を用いて3000 RPMで5分間遠心分離します。

各チューブからS上清を捨てます。同じチューブにさらに培養液を加え、再び遠心分離を行い、すべての細胞を回収するまで必要に応じてこの操作を繰り返します。各細胞ペレットを50 millilitersのオートクレーブ滅菌蒸留水で洗浄し、ボルテックスで再懸濁します。

細胞を1本の225 mLコニカルチューブにまとめ、3000 RPMで5分間遠心分離します。上清を除去した後、100 mLのリチウムアセテート溶液で細胞を洗浄します。再び3000 RPMで5分間遠心分離します。

SNAを除去し、細胞ペレットを70 millilitersのリチウムアセテート溶液で再懸濁します。ペレットが完全に再懸濁されるまで、高速で約30秒間ボルテックスします。30 degrees Celsiusで30分間、振盪しながらインキュベートします。

次に、0.1 Mのbeta me capto ethanolを加え、30 °Cでさらに30分間振盪しながらインキュベートします。30分間のインキュベーション後、煮沸して冷却したサーモン精子DNA 2 mLを細胞混合液に加えます。細胞混合液をオートクレーブ可能なシングルウェルプレートに注ぎ、その後、後続のピペッティングの妨げになる可能性があるため、形成された沈殿物をすべて取り除きます。

Biobot rapid plateを用い、あらかじめ準備した血漿DNAを含む4枚の96ウェルプレートの各ウェルに、細胞混合液を50 µLずつ分注します。この際、混合しないでください。細胞のインキュベーション中、プレートを室温で30分間、振盪せずに静置します。

PEG DMSO酢酸リチウム溶液を200 milliliters調製します。50% PEG 33,50を160 milliliters、DMSOを20 milliliters、1 molar酢酸リチウムを20 milliliters混合します。この溶液は、使用直前に調製することが重要です。

それぞれに125 µLのPEGリチウムアセテートDMSO溶液を加えます。細胞懸濁液を8回ピペッティングして十分に混ぜ合わせます。室温で30分間、振盪せずにインキュベートします。

次に、乾燥インキュベーター内で細胞を42 °Cで15分間ヒートショックさせます。ヒートショック後、プレートを重ねないようにしてください。96ウェルプレートに対応した遠心機アダプターを使用して、プレートを遠心分離します。遠心分離後、プレートを廃棄バケツの上で反転させてPEG溶液を除去します。その後、反転させたプレートをペーパータオルで吸い取ります。

残留液体を除去するため、細胞をウェルの底に残します。各ウェルに200 µLの最小培地を加え、細胞を洗浄します。プレートを再度遠心分離します。

廃棄バケツの上に倒して上清を除去し、ペーパータオルで吸い取ります。各ウェルに最小培地 200 µL を加え、プレートインキュベーターを用いて 30 °C で2日間、振盪せずに培養します。2日後、形質転換に成功した各ウェルの底に、小さな細胞コロニーが形成され始めます。

Spattingアッセイの準備として、まず新しい平底96ウェルプレートの各ウェルに、OSEベースの最小培地を200 µLずつ分注します。次に、ラピッドプレートを用いて細胞懸濁液を8回吸引・分注し、形質転換プレートの各ウェルを混合します。

ラフィノースプレートの各ウェルに、形質転換プレートから細胞混合液を5 µLずつ接種し、30 °Cで1日間インキュベートする。翌日、各ウェルの底に小さなコロニーが形成されているはずである。

スポットアッセイはクリーンベンチ内で行います。96ピンレプリケーターまたはフロッガーを火炎滅菌します。フロッガーを用いてコロニーを混合し、選択培地プレートにスポットします。スポット後、プレートをクリーンベンチ内で5～10分間乾燥させます。

プレートを30 °Cで2〜3日間インキュベートします。ここに示しているのは、TDP-43の毒性のサプレッサーおよびエンハンサーを特定するための酵母プラスミド過剰発現スクリーニングの代表的な結果です。TDP-43は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）またはルーゲリッグ病の発症に関与しているヒトタンパク質であり、酵母細胞内でTDP-43を発現させると凝集と細胞毒性が引き起こされます。

これらのプレートには、ガラクトース誘導性の T DP 43 プラスミドを組み込み、さらに flex 遺伝子 ORF 発現ライブラリー由来のプラスミドを形質転換したコロニーが表示されています。ここでは、赤色色素が蓄積する変異をこの株が持っているため、コロニーが赤色に見えます。左側のプレートにはグルコースが含まれており、これにより T DP 43 または flex 遺伝子プラスミドの発現が抑制されています。

右側のプレートにはガラクトースが含まれており、これによりflex遺伝子プラスミドにおけるTDP 43およびO Fsの発現が誘導されます。緑色の矢印は、成長が速くコロニーの密度が高いことから、TDP 43の毒性を抑制するプラスミドが形質転換されたコロニーを示しています。赤色の矢印は、成長が遅くコロニーの密度が低いことから、TDP 43の毒性を増強するプラスミドが形質転換されたコロニーを示しています。

このビデオを視聴することで、細胞由来の血漿DNAのアボイドライブラリを構築する方法について十分に理解することができます。