ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

この実験の全体的な目的は、最適化されたトランスフェクションおよび核導入プロトコルを用いて、ヒト人工多能性幹細胞において高いトランスフェクション効率を達成することです。これは、まずヒト人工多能性幹細胞のフィーダーフリー培養を確立することによって達成されます。トランスフェクションのために、ヒト人工多能性幹細胞をgelt、TRX、またはmatrigel上に一晩播種します。

核導入については、トリプシンを用いて小さな細胞塊を回収し、プラスミドDNAとGeneJuiceトランスフェクション試薬の混合液を播種した細胞に添加した後、プレートを遠心分離し、37 °Cでインキュベートします。ヒトiPS細胞懸濁液を核導入装置で核導入し、細胞をMeth条件培地で再懸濁して37 °Cでインキュベートします。最終的に、ヒトiPS細胞における高いトランスフェクション効率を通じて、効率的な遺伝子操作が行われた結果を得ることができます。

以前に報告されたエレクトロポレーションによるトランスフェクションや核注入法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、ヒトiPS細胞において、一貫した結果を伴う高いトランスフェクション効率を当研究室で日常的に達成できることです。また、当研究室のプロトコルでは、遺伝子改変後の細胞死を最小限に抑えることができます。したがって、本プロトコルを用いることで、トランスジェニックヒトiPS細胞株を迅速かつ大規模に作製することが可能です。ヒト人工多能性幹細胞をフィーダーフリー培養に適応させる前に、ゲルトリン（Geltrex）コーティング済みのディッシュを準備してください。

次に、フィーダー細胞上で維持していたヒトIPCに、1ウェルあたり1 mLのAccutaneを加え、37 °Cで1分間、またはほとんどの細胞が剥離し始めるまでインキュベートします。その後、10〜15個のガラスビーズを細胞に加え、プレートを穏やかに揺らします。続いて、2 mLのknockout D-M-E-M-F 12を加え、穏やかにピペッティングします。この細胞懸濁液を10 mL centrifuge tubeに移します。

室温で800 RPMで3分間、細胞を遠心分離します。ヒトiPSCペレットを保持したまま、上清を吸引除去します。チューブを軽く叩き、細胞ペレットを優しく分散させます。

Reese、ヒトiPSCペレットを適切な量のSTEMpro培地で懸濁し、gel TREコートプレートの各ウェルに分注してください。増殖速度に応じて、ヒトiPCは1:2から1:6の分割比で継代させることができます。プレートを5% carbon dioxide、37 degrees Celsiusのインキュベーターに慎重に設置し、プレートを軽く揺らして細胞が各ウェルに均一に分布するようにしてください。

細胞には毎日培地を供給してください。細胞密度が80%に達したら、新しいゲルへの継代が可能です。最適なトランスフェクション効率を得るためには、トランスフェクション当日に、1:2の分割比でRexコーティングされたウェルに播種した細胞の密度が約40〜50%であり、小さなコロニーとなってゲルコーティングされたウェル上に均等に分散している必要があります。

この手順を開始するには、滅菌済みの1.5 mLエッペンドルフチューブに100 µLのノックアウト培地を用意します。27 µLのGeneJuiceトランスフェクション試薬を加え、よく混ぜて室温で5分間インキュベートします。次に、4 µgのプラスミドDNAを加えます。

最適なトランスフェクション効率を得るためには、プラスミドの選択が極めて重要です。本手法で使用するプラスミドは、ヒトIPCにおいて転写活性の高い強力なプロモーターであるCAGプロモーターによって駆動される、強化緑色蛍光タンパク質（enhanced green fluorescent protein）を搭載しています。チューブを室温で15分間インキュベートします。

15分後、遺伝子ジュース（DNA混合液）を細胞に添加し、プレートを揺らして混ぜ合わせます。ウェル内のヒトIPCとトランスフェクション混合液の接触を増やすため、プレートを1,200 RPMで5分間遠心分離します。その後、細胞を37°Cで翌日まで一晩インキュベートします。

核移行効率を確認するため、核移行処理を行う日に、ヒトiPCを10 µMのROCK阻害剤で37 °Cで1時間以上前処理します。ヒトiPCの前処理を行っている間に、滅菌済みの1.5 mLエッペンドルフチューブにヒト幹細胞核移行溶液を82 µL準備します。そこに80 µLを添加します。

サプリメントを1つ加え、ピペッティングしてよく混ぜ合わせます。溶液を37 °Cで5分間インキュベートします。あらかじめ調製しておいたフィーダー細胞条件化培地および0.25% Trypsin-EDTAを、クリーンベンチ内で37 °Cに予熱します。

滅菌済みの15 mLコニカルチューブ1本にラベルを貼ります。核転換を行うヒトiPSC培養液から培地を慎重に取り除き、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を穏やかに洗浄します。PBSを吸引し、トリプシンを加えて37 °Cで3分間細胞をインキュベートします。

核酸導入を成功させるには、トリプシン処理で細胞を単一細胞にまで分散させないことが重要です。代わりに、細胞を2〜3個の細胞からなる小さな凝集塊になるようにトリチュレーション（物理的分散）してください。P1000ピペットチップを用いて細胞を穏やかに再懸濁し、2〜3個の細胞からなる小さな凝集塊にします。

ウェル底を繰り返しピペッティングして洗浄し、すべてのヒトIPCが完全に剥離したことを確認します。次に、細胞懸濁液をラベル付けした15 milliliterコニカルチューブに移します。続いて、マウス胚性線維芽細胞用培地を9 milliliters加えます。

トリプシンを不活化させるため、細胞を800 RPMで3分間遠心分離します。細胞ペレットを壊さないよう、注意深く上清を吸引します。その後、あらかじめ加温したヒト幹細胞核抽出用溶液100 µLで細胞を懸濁させます。

1 mLピペットチップを用いて、細胞を核エフェクターチューブに移します。細胞懸濁液に4 µgのプラスミドDNAを加え、チューブを穏やかに回転させて細胞とDNAを混合します。チューブをフードの表面に2回軽く叩きます。

核エフェクターデバイスの核エフェクターホルダーにビュエットを挿入します。ボタンxを押し、プログラム B 0 1 6 nuclear effect cells を選択します。通常1～5秒で核エフェクト処理が完了すると、Okayが表示されます。核エフェクトキットに付属のプラスチック製パスタピペットを使用して、ビュエットから核エフェクト細胞を回収します。あらかじめ加温したCMおよびrock inhibitorを入れた滅菌済みの1.5 milliliter eend orphで再懸濁して細胞を回収し、37 °Cで10分間インキュベートします。

10分後、1 mL ピペットチップを用いて、細胞をフィーダー層の上に滴下して移します。細胞を 37 °C で一晩インキュベートし、翌日に導入効率を確認します。

ここでは、GeneJuiceを用いて transfection された EGFP 発現 RIV one ヒト iPSC 細胞の、プラスミド DNA transfection から 12 時間後の GelRed 染色の顕微鏡写真を示します。強力なプロモーターを備えた GeneJuice を用いてヒト iPSC に transfection を行うと、通常、一過性 transfection アッセイにおいて 60% 以上の EGFP レポーター発現細胞が得られます。

EGFP発現細胞は、核注入によっても得ることが可能です。これらの画像は、B 0 1 6核注入プログラムまたはA 0 2 3核注入プログラムを用いて核注入を行い、フィーダー細胞上に播種して形成させたRIV oneヒトiPS細胞を示しています。B 0 1 6プログラムを使用した場合は最大80%のEGFP陽性細胞が得られましたが、A 0 2 3プログラムではEGFP陽性細胞は10%未満でした。さらに、トランスジーンを発現する導入遺伝子組換えヒトiPS細胞の安定クローンを誘導することも可能です。

ここに、GeneJuice由来の普遍的なEGFP発現を持つ、安定的にEGFPを発現するヒトiPS細胞コロニーの例を示します。これらの細胞は、胚様体分化の間も構成的なEGFP発現を維持します。このビデオを視聴することで、ヒトiPS細胞への核導入およびトランスフェクションの方法について十分に理解できるはずです。

効率的な遺伝子操作は、幹細胞生物学のさまざまな側面を研究するための不可欠なツールであり、再生医療におけるヒトiPS細胞株の利用を加速させるものです。