の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス

この手順の目的は、RNAiベースのゲノムスクリーニングと蛍光タグ付きタンパク質を用いて、C. elegansにおけるタンパク質発現および局在の胚後調節因子を特定することです。適切なスクリーニング系統を構築した後、RNAiライブラリを選択します。この手順の最初のステップは、ライブラリクローンを細菌にパッケージングすることです。

その後、細菌を選択して培養し、ステージを合わせたC. elegans線虫に与えます。線虫を72時間成長させた後、目的の表現型に変化があるか観察します。最終的に、標的タンパク質の発現または細胞内局在の変化を蛍光顕微鏡で可視化します。

本手法を用いることで、蛍光タグ付きタンパク質の適切な細胞内局在に必要な遺伝子を特定することができます。ただし、本プロトコルを改変すれば、関心のある他の胚発生後の表現型に影響を与える遺伝子の特定にも適用可能です。既存の公開プロトコルに対する本手法の主な利点は、プレート播種前に細菌内で二本鎖RNAの産生を誘導させることで、個体におけるRNAi応答の整合性とレベルを最適化した点にあります。

本手順の実演は、私の研究室のリサーチアソシエイトであるKathy fussが行います。実験開始から2か月以内にクローンライブラリーを調製してください。まず、選択したフィーディングライブラリークローン、およびポジティブコントロールとネガティブコントロールの細菌をLB carbonic tetracyclineプレートにストリークします。ポジティブコントロールには、BLE fourなどの用量依存的な胚後表現型を誘導する遺伝子を含むクローンを使用してください。ネガティブコントロールには、空ベクターまたは表現型が観察されない予測擬遺伝子を含むクローンを使用してください。

プレートを一夜培養し、各クローンについて、50 µg/mLのカルベニシリンを含む2 mLのLB培地にストリークプレートから単一コロニーを接種します。培養液を振盪しながら一夜培養してください。翌朝、溶液が混濁していることを確認し、IPTGを培養液に添加して二本鎖RNAの産生を誘導し、同じ条件下でさらに4～5時間培養します。

IPTGを添加することで、IPTGのみおよびNGMプレートのオーガーに頼るよりも、遺伝子産物のRNAi誘導ノックダウンをより一貫して強力に行うことができます。IPTGでのインキュベーション後、各クローンの培養液30 µLを、準備した24ウェルNGM RNAiプレートの各ウェルにスポットします。1ウェルにつき1クローンとし、各プレートの2ウェルをコントロール用に使用してください。

各ライブラリーの位置を慎重に記録します。24ウェルプレートにクローニングし、プレートの蓋を開けた状態で滅菌フローフード内に置き、約20分間乾燥させます。アガーの端がプレートから剥がれないように注意してください。

段階的に分画した線虫をプレート上に乾燥させた後、線虫の調製に関する手順を説明します。次のセクションでは、第1段階幼虫（L1期）の分画集団から開始してください。L1期幼虫から開始することで、潜在的な胚致死表現型を回避できます。

段階的なステージの個体群を用いてスクリーニングを行うことで、観察された変動が単なるステージごとの自然な変動ではなく、RNAiによるものであるという確信を高めることができます。ただし、RNAiによって発生の遅延が生じた場合は、スクリーナーがそれを記録する必要があります。スクリーニング系統の混合ステージ個体群を漂白（Bleach）します。

卵殻に保護された胚のみがこの工程を生き残ります。20 °Cで実施した場合は12時間以内、16 °Cで実施した場合は18時間以内に動物をステージングします。細菌培養物を接種した日に、健康的で、妊娠した成体と胚の両方が含まれているスクリーニング株の動物が入った100 mmプレートを3枚選択してください。

すべての動物を滅菌済みのM9培地で洗浄し、洗浄液をスクリューキャップ付きの滅菌済み15 milliliterチューブに移します。洗浄液が3.5 millilitersを超える場合は、遠心分離して動物を沈殿させ、液体を3.5 millilitersまで除いてください。3.5 milliliters未満の場合は、

水またはM9バッファーを用いて液量を3.5 millilitersまで増やし、各洗浄ステップで水酸化ナトリウムと漂白剤の混合液1.5 millilitersを加えて、成体から胚を分離させます。この溶液中での動物のインキュベーション時間は最大10分までとしてください。タイマーを開始した後、各チューブを10秒間ボルテックスし、2分ごとにボルテックス操作を繰り返します。

ボルテックス処理を行うたびに、解剖顕微鏡下で溶液を観察し、成体の死骸を確認します。6〜8分以内に成体が断片化され、胚が放出されます。遠心分離により胚をペレット化し、ペレットを乱さないようにして上澄み液を可能な限り除去し、漂白液から胚を回収します。

次に、滅菌済みのM9バッファーを加えて液量を10 millilitersにし、攪拌してペレットを再懸濁させます。漂白剤の臭いが完全に消失するまで、この洗浄工程を少なくとももう一度繰り返してください。動物のステージをより厳密に揃えるには、餌のないM9培地で胚を孵化させ、L1ステージで停止させます。

M9バッファー中の胚を小さな三角フラスコに移します。その株および実験に適した温度で、フラスコを一晩振盪します。これにより、動物はすべて孵化し、翌日にL1ディアポーズ状態で停止します。

準備した二本鎖RNAを発現する細菌へと幼虫を移し、設定した時点から幼虫の成長を再開させます。これは、24ウェルプレートに細菌をスポットした日と同じ日です。まず、L1期の個体を15 mLチューブに移し、遠心分離して沈殿させます。次に、個体を0.5～1 mLのM9バッファーで濃縮し、濃縮した線虫5 µLをプレート上に分注します。

プレート上の個体数を数え、濃縮線虫溶液を調整します。3～10 µLあたり30匹の線虫となるように調整してください。最後に、準備した各ウェルの細菌の上に、L1ステージの個体を約30匹ずつスポットします。

24ウェルプレートにおいて1ウェルあたり30匹以上の動物を飼育すると、飢餓状態になる可能性があります。スポットが乾燥するまで数分待機した後、ゴムバンドで蓋を固定します。動物を目的のステージでスコア判定できるよう、指定の温度と期間で倒置状態でインキュベートします。線虫がスクリーニング可能な状態になったら、陽性対照および陰性対照が期待される表現型を示すことを確認してください。その後、実験群の動物に発育異常が見られるか観察します。

次に、解剖顕微鏡を用いて、各ウェルから8〜12匹の個体を5 µLの麻酔薬とともに4%Agri PETスライドに載せます。適切なカバーガラスを被せた後、複合顕微鏡を用いて少なくとも5匹の個体を観察します。遺伝子、観察個体数、および表現型結果を整理したデータベースを作成してください。

各RNAi実験において、得られたRNAi表現型は、可能であれば別の二次的な表現型を用いて検証し、さらに実験を繰り返して確認してください。再現実験には、同一のストリークから採取した細菌を使用できます。保存期間の長いストリークでは、液体培地での一晩培養において増殖が悪くなる可能性があるため、まず再ストリークを行ってください。また、プラスミドで発現している遺伝子産物の影響により、増殖が不十分な細菌培養物もあります。

この場合、プレートに播種する前に単に細菌を濃縮してください。継続的なスクリーニングを行う際は、ステージングのために常に十分な数の胚を準備しておくことが重要です。スクリーニングに用いる系統には、常に餌を与え（飢餓状態にせず）、目的の表現型に影響を及ぼす可能性のあるコンタミネーションがない状態を維持する必要があります。

動物への給餌に関する維持スケジュールを策定しました。このスクリーニング用に設計された系統を用い、RNAiによってDBL oneの局在に影響を与える遺伝子を特定しました。GFPタグ付きdbl oneの正常な発現には、腹側神経索の細胞体と、DBLに対するアンチセンスRAを投与した動物における一列の点状構造が含まれます。

1つのmRNAでは、DBL oneの発現が著しく減弱していました。これらの個体は、機能的なDBL L oneを欠損した個体と同様に小型でした。このRNAiスクリーンにより、DBL oneの局在に影響を与える産物を有する他の多くの遺伝子を特定することに成功し、これによりTGF betaの細胞内輸送に関する理解が深まり、さらなる多くの研究への足掛かりが得られました。

この手法を用いれば、1人で毎週2〜4セットの実験を無理なく準備し、観察することが可能です。例えば、月曜日と火曜日に準備した動物をそれぞれ木曜日と金曜日に観察し、さらに金曜日と土曜日に動物を準備して、翌週の月曜日と火曜日に観察するといったスケジュールを組むことができます。スクリーニングの間、この手順に従って観察を行ってください。

ステージングのために十分な数の胚を常に準備しておくことが重要であるため、スクリーニング系統を定期的に維持してください。また、すべての観察結果について詳細な記録を取ることが重要です。