複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

このビデオ論文では、化学的にブロッキングした抗体マイクロアレイを用いて、肝細胞癌患者の血清サンプル中の20種類の異なる糖タンパク質の糖鎖プロファイルを取得する手順について解説します。まず、糖タンパク質特異的抗体をマイクロアレイスライド上に直接プリントし、レクチンの結合を防ぐために抗体の糖鎖をブロッキングします。患者の血清サンプルを添加すると、サンプル中の糖タンパク質が抗体によって捕捉されます。その後、ビオチン化糖鎖結合タンパク質を添加して糖鎖を検出し、さらに標識用のNeuTravainを添加してビオチン化レクチンをラベルします。

次に、マイクロアレイスライドをスキャンして蛍光を検出します。得られたデータの解析により、サンプルタンパク質の糖鎖プロファイルが明らかになります。この手法は、HPLCなどの既存の手法と比較して、いくつかの利点があります。本手法により、個々の糖タンパク質を天然の状態のまま検出することが可能です。

複数のタンパク質の糖鎖修飾の変化を同時にスクリーニングする方が、より迅速かつ容易です。さて、私たちは疾患、特に最も詳細に検討してきた癌や肝癌のバイオマーカーが、しばしば糖鎖修飾を受けていることを見出しました。そして、特定の糖鎖形態を検出できる能力が、バイオマーカーの感度および特異度における性能を大幅に向上させることが分かりました。

これにより、HCCにおける複数の血清タンパク質の糖鎖修飾の変化に関する知見を得ることができます。また、膵がん、糖尿病、アルツハイマー病など、他の疾患やがんの病理学的研究およびバイオマーカー探索にも適用可能です。本手順の実演は、私の研究室の技術者であるChen Luが行います。

まず抗体マイクロアレイを調製して、本プロトコルを開始します。氷上で0.8 mLマイクロ遠心チューブを用い、マイクロアレイプリントに使用するすべての抗体を、40 µL以上のPBSで0.5 mg/mLの濃度に希釈します。ここでは、26種類の異なる抗体をポジティブコントロールとして使用します。同様に、PBSで調製した0.5 mg/mLのビオチン化BSAを同量準備します。ピペッターを使用して、各抗体40 µLを氷上の384ウェルソースプレートに分注します。

次に、マイクロアレイ制御ソフトウェアで、各抗体の位置を指定します。続いて、ソースとしてプレートをマイクロアレイにロードします。その後、ターゲットとして20枚の病理マイクロアレイスライドをマイクロアレイにロードします。

マイクロアレイの設定を行い、27種類の抗体およびコントロールタンパク質を9×9のパターンで3連（トリプリケート）でスポットした、同一のサブアレイを48個プリントするように指定します。抗体マイクロアレイスライドのプリントを開始します。抗体マイクロアレイスライドを回収し、乾燥剤と共にスライドカセットに入れて保存します。

タンパク質の変性とスライドへの水分の付着を防ぐため、カセットをプラスチック袋で密封します。密封したマイクロアレイスライドは、使用時まで4°Cで保存してください。本手順において、最も困難かつ重要な工程は、化学的ブロッキングの手順です。

成功させるためには、マイクロアレイ上に十分な量の抗体をプリントすることが極めて重要です。ナトリウムIDEとアグロ酸ハイドロサイトは、必ず実験の直前に調製してください。また、酸化処理は光を避け、4°Cで実施してください。

マイクロアレイスライドを冷蔵庫から取り出し、室温で30分間平衡化させます。保存ボックスからスライドを1枚取り出します。0.1% tween 20を含むPBSを入れた洗浄槽に、スライドを短時間浸します。

その後、スライドを0.1% tweenを含む15 millimolar 酢酸ナトリウム緩衝液に10分間浸します。次に、15 millimolar 酢酸ナトリウム緩衝液を用いて新鮮な150 millimolar 過ヨウ酸ナトリウム溶液を調製し、スライド洗浄槽に移します。使用時まで遮光して冷蔵庫で保存してください。スライドを酢酸ナトリウム緩衝液から取り出し、抗体側を上にして新鮮な過ヨウ酸ナトリウムを含む洗浄槽に入れます。

遮光のため、バスンをアルミホイルで覆います。次に、スライドバスンを4 °Cに置き、緩やかに振盪しながら2時間静置します。バスンからスライドを取り出し、酢酸ナトリウム緩衝液で5分間、3回短時間ずつ洗浄します。

室温で緩やかに振盪しながら、新鮮に調製した10 millimolarのヒドログルタミン酸ブロッキング溶液300 millilitersを入れたインキュベーションチャンバー内で、スライドを2時間インキュベートします。チャンバーからスライドを取り出し、0.1% tween含有PBSで3分間洗浄します。次に、スライド洗浄 basinsを用いて、0.5% tween含有PBSで調製した1% BSA溶液300 milliliters中で、マイクロアレイスライドを室温で緩やかに振盪しながら1時間インキュベートします。

スライドを0.1% Tween含有PBSで3分間、3回洗浄します。次に、スライドをスライドラックにセットし、1,200 ×gで2分間遠心分離してマイクロアレイスライドを乾燥させます。各サブアレイを分離させるため、スライドにはワックスグリッドが刻印されています。

ワックスインプリンターを70°Cで5分間予熱した後、抗体側をワックスに向けるようにして、ブロッキング済みマイクロアレイスライドをワックスインプリンターにセットします。ハンドルをゆっくりと引き、スライド上にワックスを均一に転写します。この方法は、単一サンプルのグリコプロファイリングアッセイ、または複数サンプルにおける単一のグリコエピトープの測定のいずれにも使用可能です。

ここでは、糖鎖プロファイリングアッセイについて実演します。まず、40 µLの血清を、0.1% tween 20、0.1% bridge 35、およびマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバの各IgGを100 µg/mLずつ含む360 µLのPBSで希釈します。この液量は、各サブアレイに希釈血清溶液を6 µLずつ分注するのに十分な量です。

希釈したサンプルまたはコントロールを、スライドの各サブアレイに6 µLずつ慎重に分注します。濡れたペーパータオルを入れた加湿カセットに入れ、室温で1時間インキュベートします。0.1% Tween含有PBSで、3分間を3回、スライドを洗浄します。

その後、スライドを1200 ×gで2分間遠心し、乾燥させます。0.8 mLマイクロ遠心チューブを用いて、PBS-Tween中で10 mg/mLに調製したビオチン化糖鎖結合タンパク質20 µLを氷上で準備します。希釈したビオチン化レクチン6 µLをスライドの各サブアレイに滴下し、濡れたペーパータオルを入れた加湿スライドボックスに入れ、室温で1時間インキュベートします。

前述と同様に0.1% Tween含有PBSでスライドを3回洗浄した後、遠心分離機を用いて1200 ×gで2分間回転させ、スライドを乾燥させます。0.8 mLマイクロ遠心チューブを用いて、氷上でPBS 0.1% Tweenに溶解した10 mg/mLのDITE 5 49標識neutravidinを400 µL調製します。リピートピペットを使用して、各サブアレイに6 µLのDITE 5 49標識neutravidinを滴下し、加湿スライドカセット内で室温で1時間インキュベートします。

スライドをPBS 0.1%tweenで3分間、3回洗浄します。遠心分離機を用いて1200 ×gで2分間回転させ、スライドを乾燥させます。蛍光マイクロアレイスキャナーを用い、10 mmの解像度でスライドをスキャンします。

レーザーおよびPMTの設定は、飽和が観察されない範囲で最大限に強く設定してください。Array Pro 3.2で画像を開きます。抗体スポットの位置を示すアレイマップに従って、アレイテンプレートを設定します。

各テンプレートサークルを画像の対応するスポットに慎重に合わせ、各スポットの強度をExcelファイルに抽出して後続の解析を行います。20種類の血清糖タンパク質およびビオチンに対する26種類の抗体を含む、48個の同一サブアレイで構成される抗体マイクロアレイ（BSA添加）を、ブロッキング手順の重要性を検討するために、本ビデオで説明するように設計および作製しました。

糖タンパク質のプロファイリング分析において、2枚の同一なマイクロアレイスライドを作成しました。1枚は化学的なブロッキングを行わず、もう1枚はコントロールサンプルを1列目と3列目のサブアレイに適用し、プールしたHCC血清サンプルを2列目と4列目のサブアレイに適用しました。

次に、異なる糖鎖に特異的なビオチン化レクチンを、これらのサブアレイの画像に示すように、各サブアレイに適用しました。非ブロッキング処理を施したマイクロアレイでは、レクチンがコントロール列のキャプチャー抗体に結合し、血清をロードした列と区別がつかない高いバックグラウンドが認められました。しかし、化学的ブロッキングを施した抗体マイクロアレイスライドで同様の実験を行ったところ、コントロール列のキャプチャー抗体への結合はほとんど、あるいは全く認められず、血清ロード列では高い抗原結合が認められました。

これらの結果は、抗体で捕捉した糖タンパク質の糖鎖を測定する際、化学的なブロッキング手順が極めて重要なステップであることを示しています。このプロトコルに従うことで、習熟すればHCC血清中の22種類の糖タンパク質の糖鎖プロファイルを得ることが可能です。適切に実施すれば、この手法は8時間で完了させることができます。なお、抗体は修飾されると、抗原に対する親和性やその他の特性を失う可能性があります。

したがって、この点を考慮し、本手順に従って異なる供給元の複数の異なる抗体を使用することが重要です。糖鎖付加の変動がタンパク質発現レベルの変化によるものか、あるいは個々のタンパク質の糖鎖付加の変動のみによるものかという追加の疑問に答えるために、同一のマイクロアレイスライドを用いて各タンパク質濃度を検出するといった他の措置を実行することも可能です。病原体を含む血清試料を扱うことは極めて危険であるため、本手順の実施中は常に保護手袋などの予防策を講じることを忘れないでください。