ストップトフロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元と酸化の半反応を監視する

この手順では、ストップトフロー装置を用いてSID Aの異なるスペクトル形態を検出し、速度を測定します。SID Aによって触媒される反応は、FADの還元半反応と酸化半反応に分けることができます。酸化型フラビンがN-A-D-P-Hに結合して反応し、還元型フラビンとNADPが生成されます。さらに、分子状酸素との反応およびオルニシンの結合により、C fourが形成されます。

オルニチンの水酸化後、ヒドロキシフラビンが脱水して酸化型酵素が形成されます。NADP⁺は触媒サイクル全体を通じて結合しており、最後に放出される基質となります。ストップフロー装置を用いることで、少量の反応物の迅速な混合と記録が可能になります。

分光光度計を用いて時間の経過に伴うスペクトルの変化を追跡することで、酵素触媒反応、特に一過性中間体の生成速度および消失速度を測定することができます。当研究室のメンバーであるRita RobinsonとEnviro Romeroが、モデルシステムとしてフラビンモノオキシゲナーゼを用い、セットAを使用してこれらの実験を実演します。スターバーを入れた500 mLのブフナーフラスコに、100 mMのリン酸カリウム緩衝液を250 mL注ぎます。

フラスコをゴムストッパーで密閉し、スターラープレートの上に置いて、フラスコの短いチューブをシュレンクラインに接続します。室温で撹拌しながら真空下で1時間、バッファーを脱気し、続いてアルゴンで置換します。この操作を5回繰り返します。

最後に、フラスコ内をArgonで10秒間パージします。真空マニホールドからフラスコを取り外し、グローブボックス内に入れます。フラスコを開いた状態で、引き続き激しく撹拌してください。

リザーバーシリンジに 18.13 units/mL のグルコースオキシダーゼおよび 100 mM のグルコース溶液を満たします。次に、駆動バルブをロード位置に設定します。駆動シリンジを満たします。

次に、Fバルブをドライブ位置に回します。Pro Dataコントロールソフトウェアを使用して、「empty the stop syringe（ストップシリンジの空にする）」をクリックし、対応するドライブラムを手動で上昇させ、ドライブシリンジFからフロー回路にバッファーを押し出します。他の3本のドライブシリンジについても同様に操作し、1時間平衡化させます。

次に、リザーバーシリンジを補充し、停止していたフローシステムのフラッシングを繰り返します。酸素飽和バッファーを調製するには、溶液を撹拌しながら100% oxygenで1時間バブリングします。

次に、バイアルから短い針を抜き、10秒間待ちます。続いて長い針を抜き、閉じたバイアルをグローブボックスに入れます。これはN-A-D-P-H溶液に対する手順です。

1 mgのNADPHを含む1.5 mLのエプンドチューブをグローブボックス内に入れます。100 mMの嫌気性リン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）300 µLに溶解させます。

N-A-D-P-H濃度を測定するため、30 µLを取り出します。次に、酵素ストックから酸素を除去するため、溶液を撹拌子、キャップ、ストッパー、およびアルミシールを備えた25 mLバイアルに移します。氷上に保持してください。

シュレンクラインに接続し、真空状態で20分間脱気した後、アルゴンで置換します。最後に、バイアル内をアルゴンで10秒間パージし、真空マニホールドから取り外します。バイアルをグローブボックス内の氷上に置きます。

ProDataコントロールソフトウェアのコントロールパネルウィンドウで、フォトダイオードアレイ、外部トリガー、および対数スケールを選択します。また、ProDataビューアソフトウェアを起動し、データファイルの保存ディレクトリを指定します。

次に、リザーバーシリンジCおよびFの溶液を、嫌気性の100 millimolarリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5に交換します。CおよびFのバルブをドライブ位置に回します。pro data制御ソフトウェアの「empty the stop syringe」をクリックします。

次に、対応する駆動ラムを手動で上昇させ、両方の駆動シリンジからバッファーを流路に押し出します。リザーバーシリンジCおよびFを用いた洗浄をさらに3回繰り返します。流路からグルコースオキシダーゼを完全に除去するため、pro data controlソフトウェアのbaselineをクリックしてください。

リザーバーシリンジFの溶液を酵素溶液に交換します。Fバルブをドライブ位置に回します。pro data controlソフトウェアの「empty the stop syringe」をクリックします。

対応する駆動ラムを手動で上昇させ、駆動シリンジFから流路に沿って酵素溶液を押し出します。プロデータ制御ソフトウェアに戻り、収集時間を60秒に設定します。両方の駆動シリンジにそれぞれの溶液が充填されており、駆動ラムが駆動シリンジのピストンに接触していることを確認してください。

両方のバルブをドライブ位置に回し、Pro Data Controlソフトウェアのacquireをクリックしてドライブを実行します。ドライブから得られたA 452 nanometerの値を用いて、酸化型酵素のスペクトルデータを3回測定します。混合前の酵素濃度を決定し、4 mLのN-A-D-P-H溶液を調製します。

1.5倍に濃縮したN-A-D-P-H溶液で充填リザーバーシリンジCを満たし、前述のとおりストップシリンジの排出と再充填を3回行います。次に、酵素を還元させる間に、嫌気性100 millimolarリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5を用いてフロー回路内の内容物をフラッシュしながらスペクトルを取得します。その後、pro data制御ソフトウェアのbaselineをクリックしてください。

次に、200 µLの酵素ストック溶液を、1000 µLの嫌気性100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）と混合します。リザーバーシリンジAの溶液を、この酵素溶液に交換します。

pro dataコントロールソフトウェアで、Aバルブをドライブ位置に切り替えます。「stop syringe empty」をクリックします。対応するドライブラムを手動で上昇させ、ドライブシリンジAから酵素溶液をフロー回路に押し出します。

ディレイ時間を0.5秒に、測定時間を60秒に設定します。すべてのドライブシリンジに該当する溶液が満たされており、ドライブラムがドライブシリンジのピストンに接触していることを確認してください。次に、すべてのドライブバルブをドライブ位置に回し、pro dataコントロールソフトウェアのacquireをクリックします。

酸化型の酵素のスペクトルデータを3回測定します。次に、リザーバーシリンジBの溶液を、シリンジAの酵素溶液よりも1.5倍濃度が高いN-A-D-P-H溶液に交換します。Bバルブをドライブ位置に回し、コントロールパネルウィンドウに表示されている通りに、ストップシリンジの空にすることと充填することを3回繰り返します。

ディレイ時間を0.5秒に設定します。20秒で採取を行い、リザーバーシリンジの溶液を酸素飽和バッファーに交換します。Cバルブをドライブポジションに回します。

pro data controlソフトウェアで3回フラッシュを行います。ディレイ時間を15秒、収集時間を900秒に設定します。ストップトフロー装置内にて、完全に還元された酵素の再酸化が行われている間、スペクトルの収集を継続します。

N-A-D-P-HによるSID Aの嫌気的還元は、452 nmでの吸光度を用いてフラビンの還元状態の変化を測定することでモニターできます。酸化型SID Aから完全に還元されたSID Aの最終スペクトルまで、スペクトルの変化を時間とともに記録します。この酵素反応の速度は、データを適切な方程式に当てはめることで決定できます。また、ストップトフローのダブルミキシングモードを用いることで、この反応における酸化速度および反応中間体を決定することも可能です。C4a-ヒドロキシフラビン中間体は、極大吸収波長（λmax）380 nmで明確に検出され、酸化型酵素のλmaxは450 nmとなります。

この手法を習得すれば、適切に実施することで4時間から6時間で完了させることができます。溶液が嫌気状態であることを必ず確認してください。このビデオを視聴することで、迅速化学などのさらなるダウンストリーム実験に独立したmonoを用いたFLAの相対的および潰瘍性イオンの両方を調査する方法について、十分に理解できるはずです。

Quentinを用いることで、中間体の不飽和な性質を解明できる可能性があります。