に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッド

本実験の全般的な目的は、ショウジョウバエ幼虫における熱受容能を測定することです。これは、ショウジョウバエ幼虫を回収し、続いて有害な熱刺激にさらすことで達成されます。オプションとなる第2のステップとして、幼虫にUV照射を行い、組織損傷と熱受容能の感作を誘発させることができます。次に、熱プローブを用いて局所的に、またはヒートプレートを用いて全体的に幼虫を刺激し、定量的に測定可能な侵害受容反応を誘発させます。

熱プローブを用いることで、幼虫の熱に対する侵害受容反応には上限があること、および入力温度と誘発された反応の振幅との間に驚くべき関係があることが示されます。熱プレートアッセイでは、幼虫が周囲の水の温度と侵害受容感覚ニューロンの活性に依存した、定型的な一連の侵害受容行動を示すことが分かります。ここで説明する手法は、有害な熱刺激が局所的に与えられた場合と全体的に与えられた場合で動物の反応が異なるかなど、熱侵害受容分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

一般的に、ヒートプローブアッセイに不慣れな者は、プローブを適用する際の圧力、位置、および角度のばらつきを最小限に抑えるために習熟が必要であるため、困難に直面します。温度上昇に伴って誘発される行動を十分に理解するには、実際に観察することが不可欠であるため、ヒートプレートアッセイの視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。目的の遺伝子型の後代幼虫を十分に得るために、目的のストックを直接育成するか、あるいは20〜30匹の処女雌と15〜20匹の雄を用いて、フライフードを含むボトル内で交配を行います。産卵から5日後、柔らかくなったフライフードをすくい上げ、630 micronの孔径のメッシュを用いて緩やかに流れる水でろ過し、3齢初期の幼虫を回収・洗浄します。飢餓および乾燥を防ぐため、3齢初期の幼虫を少量の湿ったフードの上に移動させます。

麻酔チャンバーを作成した後、ピンセットまたは絵筆を使用して、3齢初期の幼虫10匹を蓋の内側に沿ってそっと配置し、蓋を閉めます。ドラフトチャンバー内で、1.5 mLのジエチルエーテルを浸み込ませた脱脂綿を入れた10 mLビーカーが入ったカップリングジャーの中に、麻酔チャンバーを入れます。カップリングジャーのキャップを締め、幼虫を2～2.5分間エーテル蒸気にさらします。

麻酔後、Coplanジャーから麻酔室を取り出し、残留したエーテル蒸気が消散するまでフード内で数秒間放置します。水が入った洗浄瓶を用いて、麻酔室から小さなペトリ皿へ幼虫を穏やかに洗い出します。麻酔された幼虫の水分を吸い取り紙で取り除き、3インチ×1インチのガラス製顕微鏡スライドに固定した両面テープの上に、幼虫を背面側が上になるように注意深く貼り付けます。

スライドをUV照射チャンバーの底面に置き、20 millijoules per centimeter squaredの強度で6秒間、幼虫にUV光を照射します。照射後、スライドを水に浸し、両面スコッチテープから幼虫をゆっくりと浮かせて剥がします。ピンセットまたは筆を用い、照射した幼虫を15 by 45 millimeterの容器に静かに移します。

再宿主化させる前に、1 mLのショウジョウバエ飼料を入れた1ドラムのガラス培養バイアル内で、25 °Cまたは任意の培養温度で8～24時間回復させます。温度侵害受容アッセイでは、まず温度プローブの温度を目的の設定値にプリセットします。筆またはピンセットを使用して、幼虫個体を平らなプラットフォーム上に慎重に移動させ、幼虫が薄い水の膜で覆われていることを確認してください。

圧力のばらつきを最小限に抑え、熱プローブの正確な位置と角度を確保するためには、習熟が必要です。プローブの先端を、分節A4の幼虫に対して、プローブと幼虫の表面とのなす角が約45度になるように、軽い圧力をかけてそっと押し当てます。この圧力によって幼虫の表面にわずかな窪みができ、通常はこれで移動を抑制するのに十分な状態となります。

逃避反応が示されるか、または22回目のカットオフに達するまで、幼虫への刺激を継続します。反応を示す幼虫は、通常、まず頭部と尾部を持ち上げる予備行動を示し、続いて少なくとも360度回転するという逃避行動を示します。逃避行動が開始されたら、プローブから離し、逃避までの潜時または所要時間を記録します。

20秒以内に逃避行動が観察されない場合、その幼虫は非反応者とします。十分な高コントラストの照明が確保されるよう、ファイバーオプティックライトガイドを配置してください。幼虫を観察するには、ヒーティングブロックの平坦な面を上に向けた状態でホットプレートに設置し、その後、ホットプレートを顕微鏡のベース上に配置します。

ホットプレートを強設定でオンにし、温度が95 °Cで安定するまで約15分間待ちます。マイクロピペットを用いて、80 µLの蒸留水を量り取り、60 × 15 mmのポリスチレン製ペトリ皿の中央に水滴として滴下します。ピンセットを用いて、清潔な3齢中期の幼虫を、可能な限り余分な水を加えずに、水滴の中央にそっと配置します。

シャーレをホットプレート上の固体加熱ブロックにそっと置きます。幼虫全体と水滴が視野に入るよう、速やかにシャーレの位置を調整してください。タイマーを開始します。

この時点で、ペトリ皿をホットプレートの固体加熱ブロックの上に置き、各行動の開始時間を記録します。5. 水に浸した幼虫をホットプレートに移すと、定型的な運動行動が観察されます。熱がない状態での正常な行動には、頭部の探索運動を伴うパラソル運動が含まれます。

次に、幼虫が頭部を前方または側方に素早く動かすヘッドスラッシュ動作（Head thrash behavior）が発生することがあります。この動作は水中での通常の移動に似ていますが、より不規則で持続的な回転を伴います。幼虫が側方に少なくとも360度完全に回転した際に、この行動であると定義します。

これは回数が変動して起こり、時には不完全な回転を伴うことがあります。行動のスコアリングにおいては、360度完全に回転した場合のみをカウントしてください。この行動は、鞭打ち行動（whip behavior）の最中に熱プローブを局所的に適用した際のシーンに最も類似しています。

幼虫は前後軸に沿って急速な収縮と弛緩を繰り返す動きを見せ、頭部がごく短時間に尾部に接近します。この「ホイッピング」と呼ばれる動きは、しばしば「ローリング」と同時、あるいは連続して観察されます。最終的に、幼虫は痙攣行動を示し、多くの場合その後に麻痺が続きます。痙攣行動の間、幼虫は前後軸に沿って体を伸ばし、全身に高頻度の震えを見せます。

屈曲麻痺を伴わない震え行動は、幼虫が移動を停止した際に発生します。一部の幼虫ではこれが永続的に続きますが、他の個体ではその後、低頻度の脈動的な動きを示します。各カテゴリーに属する反応個体の割合を示すこのプロットでは、幼虫の熱痛覚反応に上限があることがわかります。熱プローブアッセイにおいて、プローブ温度が 52 °C に達するまで、100% の幼虫が迅速な反応を示します。

しかしながら、54 °C以上の温度では、20秒間接触させた後でも幼虫の90%以上が反応しません。これらの幼虫は22回目のカットオフ後も動き続けますが、回転数や嫌避的逃避行動に費やされた時間を測定してプロットすることが可能です。驚くべきことに、プローブの入力温度と反応の強さの間には逆相関があるようで、より低い温度の方が回転数が増加する傾向にあります。

水に浸した幼虫をヒートプレートに移すと、5つの定型的な運動行動が観察されます。これらの行動が観察される平均潜時と、本稿で提示する最適条件において各潜時で測定された平均水滴温度をここに示します。それぞれの個別の行動を示した幼虫の割合は77%から100%の範囲でしたが、稀にローリングやウィッピング行動が省略されたり、重複したり、あるいは逆の順序で発生したりすることがありました。ヒートプレートアッセイにおいて麻痺行動が開始した後に生存した幼虫の割合をここに示します。幼虫を麻痺するまで加熱し、その後、回復させるために標準的な培養条件に戻しました。

模擬処理した幼虫には、熱曝露を除いて同等の処理を施し、生存した成虫におけるPPEの形成を7日目から13日目にかけて定量化しました。ここで、MD G fourは、4つのクラスすべての多樹状突起末梢感覚ニューロンにおいて、UAS制御下のトランスジェンの発現を誘導します。UAS or one delta Cは、シナプス伝達に必要なショウジョウバエのオープンレクティファイアカリウムチャネルの修飾版を発現し、UAS orrc one delta NCは、シナプス伝達を妨げないようさらに修飾された同チャネルのバージョンを発現します。

MD GALF 4ドライバーとUAS ORC 1 delta Cトランスジェニックの両方を保持する幼虫のみが、観察された5つの行動のうち4つにおいて潜時が延長することに注意してください。このビデオを視聴することで、有害な熱刺激に対するGEs幼虫の局所的および全身的な反応の両方を測定する方法を十分に理解できたはずです。これらの手順を遺伝学的解析などの他の手法と組み合わせることで、熱受容に必要となる遺伝子を特定することができます。熱プローブアッセイを行う際は、プローブの圧力、位置、接触角度のばらつきを最小限に抑えることが重要であることを忘れないでください。