無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

このビデオ記事では、オリゴ糖の自動溶液相合成およびポリ無水物ナノ粒子の機能化のための、新しいハイドロプットプロトコルについて解説します。これらの糖鎖ベースの標的剤を用いるため、まず、固相合成装置ではなく溶液相合成を利用する自動化システムを用いて糖質分子を合成します。次に、得られたオリゴ糖中間体を、Florescent Solid Phase Extraction（FSPE）による固相抽出で精製します。

合成された糖鎖分子をNMRで特性評価した後、カルボヒドラジド結合によりポリアンヒドリドナノ粒子に結合させます。最後に、糖鎖機能化ナノ粒子をX線光電子分光法およびヒドロキシルフェニル硫酸アッセイによって特性評価します。最終的に、ここで説明したヒドロキシル化手法を用いることで、ナノ粒子の形態および粒子表面の糖鎖密度を最適化するための反応条件が得られました。

固相オリゴ糖合成などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、ビルディングブロックの使用量を大幅に削減できることです。本手法では、通常10～20当量の代わりに2～3当量を使用します。我々がこの手法を考案したきっかけは、抗炎症細胞上のCEACAM受容体を標的とするために多糖類を用いてポリヒドロキシナノ粒子を機能化し、表面効果の有効性を実証したときでした。その後、これら新規キャリアの作製および応用に関わる複数のパラメータをスクリーニングできる、ハイスループットシステムの設計を目指しました。

オリゴ糖の高スループット合成およびポリマー粒子への結合のための自動化プラットフォームの開発は、十分な文書化がなされていない新しい研究領域であるため、本手法を視覚的に実演することは極めて重要です。diano acidの自動合成を行う前に、適切に保護された糖ドナー（通常はtri chloro acetamide）と、主にAlcon、フルオラスアルコールを含むアクセプターをベンチトップで合成し、クロロメタンで調製します。また、trimethyl silo、tri fluoro methane sulfonateをクロロメタン、80%methanol、および100%methanolで調製します。自動化チャンバー内の室内の相対湿度が30%以下であることを確認してください。

高湿度は糖鎖付加反応にとって不利に作用します。以下の手順は自動化プラットフォームを用いて行われます。最初の糖鎖付加は、ドナーとフロリストアルコールを用いて実施します。

完了後、得られたフロリストタグ糖分子をFSPEで精製します。次に、ナトリウム、メトキシド、およびメタノールを用いて一時的な保護基を除去し、再度、生成物をFSPEで精製します。その後、フロリストタグ糖をアクセプターとして用い、同一のドナーと結合させて二糖体を得ます。この二糖体をFSPEで精製し、準備を完了します。

ドナーアクセプタープロモーター、80% methanol水、100% methanol、ナトリウムメトキシドを含む試薬をロボットプラットフォームにセットし、プログラムを開始します。ロボットアームがバイアルからドナー、次いでアクセプターを分注し、反応バイアルへと移送します。その後、ドナーとアクセプターの混合物を30分間撹拌します。

30分後、ロボットアームが触媒のtrimethyl silo, tri fluoro, methane sulfonateを混合物に添加します。その後、溶液をさらに30分間撹拌します。撹拌の完了後、プログラムは一時停止します。

10 µLのアリコートを分取し、薄層クロマトグラフィー（TLC）で反応が完了したかを確認します。反応が完了している場合、アクセプター分子は検出されません。反応が未完了の場合、TLC上でアクセプターが依然として確認できます。

その場合はプログラムを停止し、糖鎖付加のタイミングを約30分にリセットした上で、プロモーターであるトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを過剰量添加します。反応が完了したら、次のステップに進みます。反応完了後、ロボットが反応混合物を、精製用のC9 F17修飾シリカゲルを含むFSPEカートリッジに転送します。

次に、カートリッジを8 mLの80% methanolで洗浄し、続いて8 mLの100% methanolで洗浄します。非floris画分を除去するため、フロースルーをバイアルに回収し、目的のflorisタグ付き生成物を得ます。さらなる精製が必要な場合は、ロボットを停止させ、適切な反応生成物を回収してください。

構造によっては、ドナーの反応性が極めて低く、十分なプロモーターを添加した後でも一部のフローリスト受容体分子が残存する場合があります。その場合、FSPEでは精製効率が不十分となるため、ロボットアームが反応バイアルにナトリウムメトキシドを分注して精製を行った後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる追加精製を実施することがあります。その後、ロボットプラットフォーム内で2時間撹拌します。TLCで確認して反応が完結していない場合は、インキュベーション時間を約1時間延長してください。

反応完了後、前述と同様にFSPEを用いて生成物を精製します。次に、ロボットから反応生成物を取り出し、ベンチトップ上で無水トルエンに溶解させ、その後、蒸発させて残留水を除去します。サンプルが乾燥したら、FSPEによるグリコシル化精製を含む同一のサイクルでロボットに戻します。

目的分子の所望の鎖長が得られるまで、一時的な保護基の深層保護とそれに続く配糖化を繰り返します。自動化によって得られた保護生成物を脱保護するため、ロボットからバイアルを取り出します。手順の最終ステップでは爆発性の水素ガスを使用するため、自動化プラットフォーム外で実施する必要があります。ベンチトップ上で、フロリストタグの二重結合のオゾノリシスを行い、続いて生成したアルデヒドをカルボン酸に酸化させます。

得られた生成物を、ジクロロメタンに30%のメタノールを混合した溶媒を用い、ベンチトップでのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製します。最後に、パラジウム触媒を用いた水素化によりベンゾエーテル基を脱保護するため、生成物をサテライトパッドに通してパラジウムを除去し、純粋な最終生成物を得ます。核磁気共鳴またはNMR分光法を用いて、生成物の完全な特性評価を行ってください。

ハイスループットなポリマー合成およびナノ粒子作製は、Petersonらによって記述されたプロトコルに従って行われます。付属文書に記載されている通り、粒子の機能化に使用される自動堆積装置は、3台のne 1000ポンプ、X方向およびY方向の移動用アクチュエータ2基を統合したロボットステージ、およびポンプの各方向に対して1基ずつ計3基のアクチュエータを備えた2つの隣接ラックを持つ第2のロボットステージで構成されており、計5基のアクチュエータが直列に接続されています。アクチュエータとポンプは、LabVIEWソフトウェアを使用したコンピュータによって制御されます。

粒子作製に使用される共重合体系は、SEBA酸またはSAと、1,6-ビス(p-カルボキシフェニル)ヘキサン（CPH）および1,8-ビス(p-カルボキシフェニル)-3,6-ジオキサン（CPTeeg）に基づいています。ナノ粒子作製後、ナノ粒子ライブラリーを含む1.7 mL遠心チューブをセットしたラックをリニアアクチュエータステージに配置し、ポリアンハイドライド粒子の表面に炭水化物を結合させます。このため、2つの連続した反応からなる平均カルボン酸カップリング反応を行います。まず1回目の反応として、プログラマブルシリンジポンプのシリンジに、ナノ粒子1 mgあたり2 mgの濃度でEDCを、およびナノ粒子1 mgあたり0.6 mgの濃度でエチレンジアミンの水溶液を満たします。

プログラム可能なシリンジポンプの2本目のシリンジに、ナノ粒子サンプル1つあたり計12等量に相当する、2.5 mg/mg粒子のNHSA水溶液を満たします。次に、LabVIEWプログラムを使用して、ナノ粒子ライブラリに試薬懸濁液を分注するようにロボットに指示します。すると、ロボットのアクチュエータがチューブホルダーをプラットフォーム上の正しい位置に移動させ、EDCおよびNHS溶液を分注します。

ポリアンヒドリドナノ粒子の表面にあるカルボン酸基を活性化し、平均的なカップリングを可能にします。次に、超音波処理用プローブを各チューブに浸し、各サンプルを40 Hzで30秒間超音波処理します。次のサンプルに移る前に、プローブをアセトンで洗浄してください。

すべてのサンプルの充填が完了したら、チューブホルダーをロボットプラットフォームから取り外します。ナノ粒子懸濁液を4°Cで一定速度で回転させながら9時間インキュベートします。最終的な糖濃度を調整するために、第1反応および第2反応の反応時間を変更することが可能です。

反応終了後、チューブを12,000 ×gで5分間遠心分離します。低温環境を維持したまま、ロボットステーションに戻します。チューブホルダーをロボットアームに再度取り付け、ロボットプラットフォームの2番目のシリンジを満たします。

冷水を使用する場合、最初のシリンジは空のままにしておきます。ロボットを起動します。各チューブの上清が空のシリンジに吸引され、同時に2番目のポンプがチューブに冷水を注入します。

この工程は、ナノ粒子懸濁液から未反応の試薬を除去するために行います。次に、以前に示した方法で超音波処理を行い、ナノ粒子懸濁液を均質化します。その後、チューブを12,000 ×gで5分間遠心分離します。

ロボット装置を用いて、2回目の反応負荷分に対し、冷水で2回目の洗浄を行います。1ナノ粒子サンプルあたり12当量のEDCを第1ポンプに、12当量のNHSを第2ポンプに充填します。ロボットプラットフォームを始動させ、ナノ粒子を含むチューブに適切な量を分注します。EDCとNHSの存在により、ナノ粒子表面にすでに結合しているエチレンジアミン由来のアミノ基と、保護糖のカルボキシル基との間にアミド結合が形成されます。

堆積が完了したら、特定の糖類を10等量ロードします。本例では、乳糖および2台のポンプにあるグリコール酸コントロールを使用しました。各糖類は、各チューブで達成したい機能化に応じて試験管に堆積されます。これは、本研究で採用された特定の反応のためのアクチュエータおよびポンプ機能を動作させるために使用されるLabVIEWプログラムであらかじめ設定されています。炭水化物の結合において、深く保護された糖類には既にこの分子が共有結合しているため、ナノ粒子表面へのさらなる結合を可能にするリンカーコントロールとしてグリコール酸が使用されます。

ナノ粒子懸濁液を前述と同様に超音波処理して均質化し、4 °Cで定速回転させながら9時間インキュベートします。インキュベート後、ナノ粒子懸濁液を遠心分離して上清を除去して洗浄し、ペレットを冷水で再懸濁して超音波処理します。機能化ナノ粒子ライブラリを含むチューブを真空チャンバーに入れ、少なくとも2時間乾燥させます。機能化ナノ粒子は、動的光散乱法およびその他の手法を用いて、表面組成、濃度、粒子径、粒度分布、および表面電荷を評価し、特性解析を行います。

ここに示されている完全保護されたdiano側鎖は、オートメーションプラットフォームを用いて合成されました。合成された化合物は、VXR 400 megahertz分光計を用いたプロトンNMRにより特性評価されました。CDC 13を溶媒として使用し、いくつかの特性ピークの存在から、産物の生成を確認することができます。

プロトンNMR図において、1.79から2.21までの4つのプロトンと3.38の2つのプロトンは、フローリストタグに由来します。2.16のシングレットピークはアセテートピークに対応し、4.94と5.11のピークはアノマープロトンであり、これらは反応時間がナノ粒子の最終的な形態および糖の結合度に及ぼす影響を評価するためのものです。ここに示すように、反応時間を長くすることでナノ粒子の機能化が行われ、50 50 CPT CPHナノ粒子表面のdiano濃度は全反応時間とともに増加し、18時間後に最大値に達しました。

24時間の全反応時間で機能化されたナノ粒子を用い、ここに示すようにフローサイトメトリーを使用して、マウス骨髄由来樹状細胞上のCLRを標的とする能力を評価しました。機能化されていないナノ粒子、およびラクトースおよびマンノースで機能化されたナノ粒子による刺激後、C型レクチン受容体に対するDC-SIGNおよびマンノース受容体の発現上昇が観察されました。これは、効果的な標的化が行われたことを示しています。

しかしながら、Diano機能化粒子はより高い発現レベルを示しており、このリガンドが研究対象の受容体に対して特異性を持つことが示唆されました。このビデオを視聴することで、オリゴ糖の高スループット自動合成およびポリナノ粒子の機能化の方法について十分に理解できるはずです。これらの糖鎖ベースの標的剤を用いる際、ドナーおよびアクセプターが保護された糖の合成と装置の組み立てを習得すれば、24〜48時間で完了させることができます。

当然ながら、所要時間はライブラリーのサイズおよび機能化の時間に依存します。本手法を実施する際は、ナノ粒子の化学的性質に応じて、生分解性ポリヒドロ粒子の機能化における反応条件を最適化できることを覚えておくことが重要です。この手順に従うことで、さまざまな構造の炭水化物を合成し、異なる細胞受容体を標的として免疫学的結果に影響を与えることが可能です。