組合せの合成と高分子膜とナノ粒子のライブラリからのハイスループットタンパクリリース

このビデオでは、生分解性ポリアンヒドリドフィルムおよびナノ粒子ライブラリのコンビナトリアル合成と、これらのライブラリからのタンパク質放出の高スループット検出について説明します。まず、高スループット自動堆積装置を用いて、組成の異なる多様なモノマーアレイをガラスキュベットに堆積させます。その後、180 °C、0.3 torの条件下で1.5時間のポリ縮合反応を行います。

これらの反応条件は、C-P-H-S-Aポリアンハイドライドポリマーの合成に特有のものです。自動分注装置を用いて、溶媒およびカプセル化のためのコンポーネントを、ポリマーライブラリを含むキュベットに分注します。ポリマーを完全に溶解させ、追加コンポーネントを均一に分散させるために、超音波処理を行うことができます。

次に、溶解したポリマーを非溶媒が入ったチューブに移し、ナノ沈殿法によってナノ粒子ライブラリを作製します。ナノ粒子を真空乾燥またはろ過によって回収し、修飾した96ウェルリリースプレートに移します。最後に、タンパク質を封入したライブラリを生理的条件下でインキュベートし、蛍光検出法を用いてタンパク質の放出速度論を評価します。

最終的に、ポリマーの特性や放出環境の条件に応じたタンパク質放出キネティクスを示す結果を得ることができます。従来の単一サンプルを個別に扱う手法に対するこのアプローチの主な利点は、複数のサンプルを同時に合成できることです。これにより、タンパク質-ポリマー間、細胞-ポリマー間、または宿主-ポリマー間の相互作用について、これらのサンプルをハイスループットにスクリーニングすることが可能になります。

これにより、薬物伝達や組織工学に向けたこれらのバイオマテリアルの合理的設計と開発が加速します。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるLa Tricia Petersonが行います。ビデオのこのセクションでは、ポリマー合成後、組成が異なるモノマーライブラリーを堆積させるために、ハイスループット堆積装置を使用します。

この装置は、ブランクまたはタンパク質を担持したポリマーフィルムおよびナノ粒子のコンビナトリアルライブラリを作製するために利用されます。この自動プラットフォームは、コンピュータに直列に接続された2台のプログラム可能なシリンジポンプと3つのリニアアクチュエータで構成されています。シリンジポンプとアクチュエータへのコマンド送信にはLabVIEWソフトウェアが使用されます。

10 ccのガス密閉シリンジをシリンジポンプに装着し、ルアーロック継手で金属キャピラリーチューブを接続して、ポリマー溶液をガラスキュベットに分注します。この実演では、セリ酸（SA）と1,6-ビス（パラ-ヒドロキシフェニル）ヘキサン（CPH）を用いて、Texas Red-BSA（ウシ血清アルブミン）を封入したナノ粒子ライブラリを作製します。本ビデオおよび付属資料の指示は、広範なポリマーフィルムおよびナノ粒子ライブラリの作製と試験に応用することが可能です。

ライブラリを合成するには、まず各モノマーをクロロホルムに溶解し、最終濃度を25 mg/mLとしてガラスバイアルに入れます。次に、ルアーロック端から溶液を吸引し、各溶液を10 ccのガス密閉シリンジに充填します。気泡はすべて取り除いてください。

次に、溶媒耐性のあるルアーロックステンレス製キャピラリーチューブをシリンジの端に取り付けます。キャピラリーチューブをクランプで固定し、リングスタンドに装着します。その後、両方のキャピラリーチューブの先端をスタートベタに配置します。

モノマーの堆積用です。シリンジをプログラマブルシリンジポンプにセットし、LabVIEWソフトウェア上で位置を固定します。ソフトウェアを使用して、リニアアクチュエータを開始位置に設定してください。

x軸、y軸、およびZ軸に沿って、SAおよびCPHモノマーをガラスキュベットへ自動的に分注します。アクチュエータによってキャピラリーチューブが各キュベットに適切に配置され、プログラムされた量の各モノマーがポンプで注入されることで、組成が異なるモノマーライブラリが作成されます。モノマーの分注後、

モノマーライブラリーを予熱した真空乾燥機に移し、180 °C、0.3 tourで1.5時間インキュベートして縮合重合させます。インキュベーション後、ポリマーライブラリーの作製が完了します。次に、タンパク質を担持させたポリマーナノ粒子を作製します。

タンパク質含有ナノ粒子ライブラリーを作製するには、タンパク質含有ポリマーフィルムライブラリー作製に関する付属のプロトコルを参照してください。この場合、ポリマーライブラリーを溶解可能な適切な溶媒に、タンパク質（ここではTexas red bovine serum albumin）を添加します。ここでは、塩化メチレンを2 mg/mLの濃度で使用します。

10 ccシリンジに溶媒を含むTexas Red BSAを満たし、1台目のシリンジポンプにセットします。次に、清潔で空の2 ccシリンジを2台目のシリンジポンプにセットし、15 millilitersの非溶媒（本例ではペンタン）を含むチューブをバイアルプラットフォームに隣接するチューブホルダーに配置します。続いて、LabViewソフトウェアでプログラムを選択し、自動溶媒堆積プロセスを開始します。

プログラムを開始すると、ポリマーライブラリを含むキュベットに溶媒が分注され、ポリマー濃度が 20 mg/mL になります。すべての溶媒の分注が完了した後、1 ～ 5 分間静置してポリマーを溶解させます。続いて、ポリマーを完全に溶解させ、タンパク質を均一に分散させるために、必要に応じてシンジケーション（攪拌）を行います。

次に、LabVIEWでサンプル転送プログラムを開始します。ライブラリ内の各溶解ポリマーサンプルを空のシリンジで吸引し、サンプルホルダーにある対応する非溶媒チューブに分注します。各サンプルの転送が完了したら、ナノ粒子ライブラリを10 mmHgの真空チャンバーに置くか、または溶媒が除去されるまで吸引ろ過を行い、タンパク質担持ナノ粒子を回収します。

カプセル化されたBSAの放出を調査するために、まず、プレート内の隣接する1列おきの各ウェルの壁の上半分（0.5インチ）を削除して改造した、ディープ96ウェルポリプロピレンプレートを用意します。列AとB、CとD、EとF、GとHの間の各ウェルの上部を取り除くことで、全量まで液体を満たした際に、隣接するウェルのペア間で液体が流れるようになります。1000から10 µg/mLの範囲のTexas red BSA標準液を、このディープ96ウェルプレートに分注します。

これらはタンパク質量の算出に使用され、フルオロクロムの消光も考慮されます。目的の質量のナノ粒子をPBSバッファーで再構成し、超音波処理して粒子を均一に分散させます。次に、ナノ粒子ライブラリをディープ96ウェルプレートに移し、サンプルがウェルプレートの底に沈殿するまで待ちます。続いて、ピペッターを用いて、隣接するすべてのウェルに、ウェル上端から1/4インチまでPBSバッファーをゆっくりと満たします。

隣接するウェル間で緩衝液が自由に流れるよう、十分な量の緩衝液を入れる必要があります。次に、リリースプレートを蓋で密封し、37 °Cで攪拌しながら保持します。実験期間中の増分時間点において、適切な励起、レーザー、および放出フィルターを用いて、9, 400 Typhoonフラットベッド蛍光スキャナーでプレートをスキャンします。

スキャン後、画像解析ソフトを用いて、各放出時に放出された蛍光色素標識タンパク質の量を定量します。本ビデオで説明したSAおよびCPHモノマーから合成されたポリマーナノ粒子ライブラリーにTexas Red BSAを封入し、ポリマー化学の関数としてタンパク質放出速度を決定しました。タンパク質をロードしたナノ粒子を37 °Cで1ヶ月間インキュベートし、その間に段階的なタイムポイントで蛍光スキャンを行い、タンパク質放出量を定量しました。

ここで示すように、このハイスループット法を用いて、A-C-P-H-S-A ポリ無水物ナノ粒子ライブラリーからの Texas Red BSA の放出キネティクスを決定しました。Sarich フィルムの化学組成に応じて放出速度が増加するという傾向が観察されました。標準的なタンパク質定量アッセイを用いた場合にも、同様の結果が得られました。

別の実験において、CPT CPHポリ無水物フィルムライブラリからのTexas Red BSAの放出を評価したところ、ここに示すように、ほぼ0次放出速度論が観察され、CPEG含有量の多いフィルムでタンパク質が最も速く放出されました。これは、生分解性薬剤放出デバイスとして、医学分野への応用の可能性があります。これらの結果は、ポリマー化学を変更することで、治療薬やワクチン抗原の望ましい放出プロファイルを制御できることを示しています。この手順に続き、タンパク質の安定性、細胞毒性、細胞活性化、およびInVivoでの生体内分布などの領域を調査するための、他のコンビナトリアル手法が開発されています。

これらの側面は、薬物送達および組織工学のためのバイオマテリアルの合理的な設計において重要です。本プロトコルの全行程において、適切な個人用保護具（PPE）を着用し、安全な実験手順を遵守してください。