細胞侵襲DISC1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション

以下に述べる手順の全体的な目的は、精製されたディスクを生成することです。1つは受容細胞に侵入可能な凝集塊です。この目的を達成するための2つの異なる方法のうち、まず最初の方法について実演します。

アポトーシス形成蛍光タンパク質Disc1融合タンパク質を、NLFヒト神経芽細胞腫ドナー細胞で過剰発現させます。その後、細胞をPBSで洗浄して回収し、界面活性剤を用いずに溶解させます。DNAを消化し、ショ糖密度勾配システムを用いてアグロゾームを精製します。

この方法で精製されたAgriosは、細胞侵入効率が低くなります。代替アプローチとして、組換えdisc oneタンパク質の5 98から7 85のアミノ酸をe coliで過剰発現させます。その後、タンパク質断片をDITE 5 94で標識し、透析を行い、NI NTAマトリックスを用いて精製することで、未結合の色素や多量体discを除去します。

この方法で生成された断片は、宿主細胞への侵入能を評価するための高い細胞侵入効率を有しています。精製された蛍光タンパク質ディスク、リボソーム、または標識されたリコンビナントディスクのいずれかを用い、断片を目的の受容細胞とともにインキュベートします。

その後、細胞外の蛍光を消去するためにトリパンブルーを加え、共焦点顕微鏡で浸潤を可視化します。これまで、統合失調症のような慢性精神疾患において、タンパク質凝集は認識された特徴ではありませんでした。統合失調症で破綻しているあるタンパク質が候補となりますが、タンパク質凝集体の細胞浸潤性は、タンパク質構造異常疾患の顕著な特徴です。

本研究では、2つの手法を用いて、disc oneタンパク質凝集体が細胞浸潤性であることを示し、したがってdisc one関連疾患またはdisc oneニューロパチーがタンパク質構造異常疾患であることを示します。2つの手法とは、第一に神経芽細胞腫細胞株からのフルレングスdisc one ASOSの精製、および第二に、E. coliにおけるC末端マルチメリックdisc oneフラグメントの発現、ならびにその精製と蛍光色素による標識です。

最初の方法は、精製されたマイクロソームを取り込む細胞の浸潤効率が約 0.3% と低くなるだけでしたが、精製組換えタンパク質断片は、曝露された細胞の最大 20% に感染します。ここで説明した方法は、アクロソーム形成またはマルチマー会合が十分に実証されている他のタンパク質にも転用できるはずです。10 cm ディッシュ 10 枚ずつのそれぞれにおいて。

補完されたRPMI 1640培地に1.5 × 10⁶個のヒト神経芽細胞腫およびLF細胞を播種し、一晩培養します。翌日、細胞のコンフルエンシーが70〜80%に達していることを確認します。5枚のディッシュにPC DNA 3.1 MRFPおよびEGFPタグ付きヒト全長disc1をトランスフェクションするためのラベルを付け、別の5枚にEGFPプラスミド単独をトランスフェクションするためのラベルを付けます。10 cmディッシュ1枚につき、15 µgのプラスミドDNA、30 µLのmet affecting、および750 µLを混合します。

マイクロ遠心チューブにOpti MEMを入れ、ピペッティングで混和させた後、室温で20分間インキュベートします。次に、細胞にトランスフェクションさせるため、DNAトランスフェクション試薬溶液を細胞に滴下し、37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートします。トランスフェクションから48時間後、MRFP full length disc oneの発現をモニターし、蛍光顕微鏡下でaggresomeの形成を確認しました。ここに示すように、一部の細胞には大量の蛍光タンパク質封入体が認められます。

本プロトコルでは、脳組織からレビー小体を精製する方法と、より大きな凝集塊またはアグロゾーンを単離するプロトコルを組み合わせています。既存の手法は界面活性剤の使用に基づいているため、細胞侵入能アッセイに適用するための界面活性剤フリーのタンパク質を単離することが重要です。次に、培地を吸引し、PBSで洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むPBSを400 µL添加します。その後、細胞をスクレイピングし、細胞懸濁液1 mLとセラミックビーズ10個を2 mLライシスチューブに加えます。

Pre-cell lyse 24ホモジナイザーを用いて、62ndパルスを3回行い細胞を溶解します。この工程による機械的な力で、サンプル内の温度が37 °C以上に上昇する可能性があります。そのため、サンプルを氷上で冷却するように注意してください。溶解工程の後、細胞を氷上で冷却し、10 mM 塩化マグネシウムと40 units/mL DNAAを加え、37 °Cで振盪しながら60分間インキュベートします。

PBSを用いて、80%、50%、20%（w/v）のスクロース溶液をそれぞれ10 mL調製します。次に、15 mLのコニカルチューブに、まず80%スクロースを2 mL、次に50%スクロースを2 mL、最後に20%スクロースを2 mLの順に加えて、スクロース密度勾配を作成します。勾配を作成する際は、既に注入された層を乱さないよう、ゆっくりと注いでください。

次に、消化したライセートをグラジエントの上に重層し、4°Cで1000 ×gで15分間遠心分離します。ブレーキを切った状態で、ピペットを用いて50〜80% sucrose層の界面を慎重に回収し、5倍量の緩衝液とともに15 mLコニカルチューブに入れ、4°Cで1000 ×gで15分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを含むアグリゾーンを回収します。

この界面で洗浄をさらに2回繰り返します。Agri zoneは蛍光を発するため、最後の洗浄後に顕微鏡のUV光下で可視化できます。上清を捨て、ペレットを250から500 µLのPBSで再懸濁してください。このペレットに精製されたagro zoneが含まれています。

SH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞を滅菌済みガラスカバースリップ上に播種した24ウェルプレートの各ウェルに、可溶性GFP-disc1 C末端を恒常的に発現させたMRFP-disc1some懸濁液を10 µLずつ添加し、48～72時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、0.04%トリパンブルーを用いて細胞外蛍光を5分間クエンチします。

その後、PBSで洗浄してトリパンブルーを除去します。次に、ディッシュを氷上に置き、4% PFAとPBSを加えて10分間細胞を固定します。その後、滅菌水で一度洗浄し、ProLong Gold DPI封入剤を用いてカバーガラスをガラススライドに封入します。

受容細胞によって発現し、動員されたタンパク質との共局在をZスタック画像で確認することで、外因的に投与されたアグロゾーンの侵入における取り込みを確認します。このZスタックは約6 µmの深さをカバーしています。

200 nanometersの間隔で撮影された24枚の画像。赤色で示されたMRFP disc one agri zoneの蛍光が、細胞質にあるGFPC terminal discをリクルートしている。緑色で示されたある断片の共局在は黄色として現れており、これはagri zoneがレシピエントの細胞質に進入し、以前は可溶性であったdisc oneタンパク質をリクルートしたことを示している。

プロトコルのこのパートでは、human disc oneをDITE 5 94で標識します。これにより、追加の免疫染色を行うことなく、組換えタンパク質を直接モニタリングすることが可能になります。まず、付属文書の記載に従って調製したfreeing proteinを、2 LのPBSを用いて1:2000の希釈倍率で3回透析し、β-mercaptoethanolを除去することから始めてください。

次に、1 mgのディスク1をDITE 5 94 IDEでラベル化します。1 mg/mLのタンパク質をPBSに溶解し、遊離TH基を回収するために5 mMのTCEPを添加します。DMFに溶解した色素20 µLを反応液に加え、室温で2時間インキュベートします。分子量カットオフ10,000 DaltonsのSLI透析カセットを用い、タンパク質をPBSで1:2000の比率で3回、各回2時間ずつ透析します。次いで、ラベル化されたタンパク質の純度をさらに高めます。

Ni-NTAカラムを用いたHisタグベースのアフィニティー精製を行います。1 mLのNi-NTAマトリックスを10 mLのPBSで洗浄し、その後、ラベル付けして透析したタンパク質をカラムにアプライして流します。

タンパク質がNTAマトリックスに結合するため、溶液の青色が徐々に薄くなります。ラベルされていない遊離色素は、フロースルーとして排出されます。タンパク質溶液をカラムに導入した後、20 millilitersのPBSでカラムを3回洗浄します。タンパク質を溶出させるために、500 millimolar imidazoleを含む2 millilitersのPBSをカラムに加えます。

バルブを低速に設定し、Ni-NTAカラム上の着色バンドをモニターしながら、滴下して溶出させます。この溶出液の着色分画には、標識された組換えタンパク質が含まれています。溶出液をSLI透析カセットに移し、10 mM NAPIに対し1:2000の希釈率で、2 Lの溶液を用いて2時間ずつ3回透析します。透析後、溶出液を滅菌済みの0.45 µmシリンジフィルターでろ過し、100 µLずつ5つのサンプルに分注して、液体窒素で急凍結させます。

各100 µLのアリコートに含まれる総タンパク質量は0.5〜1 µg/mLである必要があります。タンパク質の浸潤性を評価するため、受容体であるSH SY five Yヒト神経芽細胞腫細胞を播種した24ウェルプレートの各ウェルに、5〜10 µg/mLの標識リコンビナントdisc oneタンパク質を含む培地を添加します。可溶性GFPタグ付きdisc one C末端を恒常的に発現させた滅菌済みガラスカバースリップ上で、48〜72時間インキュベートします。

細胞外の蛍光をクエンチし、agri zone処理細胞と同様の手法で細胞を固定および封入した後、Z-stackイメージングにより外因的に添加したリコンビナントタンパク質の浸入を確認します。ラベル化されたタンパク質が取り込まれると、共焦点顕微鏡で生成された画像において、受容細胞の周囲内で検出されます。このZ-stackは、220 nanometersの間隔で24ステップ、深さ約5 micrometersをカバーします。

ここでは、赤色で示されたリコンビナントDisc1フラグメント 598-785が、緑色で示された可溶性C末端GFPタグ付きDisc1を発現しているレシピエント細胞に取り込まれ、Disc1タンパク質凝集体の浸潤性が決定されます。mRFPタグ付きフルレングスDisc1からなるアクロゾームをNLF細胞から精製し、このビデオで説明されているようにレシピエントのSH-SY5Y細胞に添加しました。mRFPタグ付きDisc1アクロゾームが、可溶性GFPタグ付きC末端Disc1を発現しているヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞に浸潤した様子がここに示されています。

さらに、MRFPタグ付きのdisc one asomeは、可溶性GFPタグ付きdisc oneを不溶性凝集塊へとリクルートすることができました。DIA lightでラベルした組み換えdisc oneの浸潤性を評価するため、ここに示すように、可溶性GFP disc oneを発現させたSH SY five Y神経芽細胞腫細胞にこれを適用しました。赤色で示された組み換えdisc oneタンパク質マルチマーがレシピエント細胞に浸潤しており、黄色の点は可溶性GFPタグ付きC末端disc oneの凝集塊へのリクルートを示しています。E coliから発現・精製したラベル付き組み換えdisc oneは、多量体タンパク質をラットの内側前頭前皮質に定位的に注入した際、in vivoにおいてもニューロンに対して細胞浸潤性を示しました。Zスタック画像により、ニューロン核に対する抗体で染色されたラット皮質ニューロン内に組み換えdisc oneタンパク質が存在することが確認されました。

細胞浸潤を研究するためのdisc one凝集体を生成する2つの方法について説明しました。これらのいずれの方法を用いても、外来DNAのトランスフェクションによる組換え遺伝子発現という、潜在的に交絡因子となる変数を排除して、disc one凝集体の取り込みによる細胞への影響を調査することができます。これらの手法は、in vitroでの細胞内におけるdisc oneタンパク質病理の生物学的影響の調査や、動物モデルへの脳内接種またはその他の投与によるin vivoでの調査に適用可能です。

これらの手法は、各タンパク質に合わせてプロトコルをわずかに修正することで、最終的に他のタンパク質凝集体にも応用できると考えています。この手順を行う際は、共焦点顕微鏡画像の詳細な解析に十分な時間を割くようにしてください。