コナジラミを使用した送信植物ウイルス

本実験の全体的な目的は、コナジラミを用いて植物ウイルスを伝播させることです。これは、他の潜在的な媒介者や病原菌に汚染されていない、羽化したばかりの成虫コナジラミを毎週供給できるコロニーを構築し、維持することで達成されます。コロニーの維持は、新しい成虫を産出させるために、昆虫のいない若いた植物に定期的にコナジラミを導入することによって行われます。

毎週17日から20日後、羽化したばかりの成虫を試験植物に転移させ、ウイルスの獲得または伝播を行います。通常、ほぼ100%の効率が得られますが、伝播率は一般的に低く始まり、系統的な最適化によって上昇します。コナジラミを用いてウイルスを接種させる際に最も困難な点は、不要な病原体や昆虫を排除するようにコナジラミを飼育することです。

病原体、特に根腐れ菌や葉枯病は、ウイルスの宿主植物の品質を低下させます。アブラムシなどの不要な昆虫は、コナジラミの繁殖を抑制するだけでなく、宿主植物の品質を損なう可能性があります。これらの手順の実演は、私の研究室の技術者であるHeather Capa Biancoが行います。

コナジラミのコロニーは、清潔で管理された育成室で維持してください。卵から成虫まで18日間で発育させるコロニーにとって、相対湿度、温度、光周期、および光強度の制御は不可欠であり、以下の設定を用いてください。温度は26〜30°Cに設定し、相対湿度は理想的には30〜50%に保ちます。相対湿度が70%を超えると、害虫や植物病原菌が発生しやすくなります。

理想的な光周期は14時間です。光強度はかなり高く設定する必要があり、VHO蛍光灯を使用することで植物のキャノピー部分に800から1000 foot candlesの光量を確保できます。また、菌類による病原体や塩分の蓄積を防ぐため、肥料の投与量と水やりを減らさなければなりません。Whitelyケージは、換気が行われ、アクセスが容易で、増加するwhitely個体群にとって十分なスペースが確保されている必要があります。

有機オーガンジーにアルミニウムスクリーンを組み合わせた方法や、白色の遮光スクリーンを用いることで良好な結果が得られています。植物種の選択は重要な検討事項です。第一に、成長が早くなければなりませんが、チャンバー内を覆い尽くしてはなりません。第二に、植物は昆虫が高密度に生息しても倒伏せずに耐えられる十分な強度を備えている必要があります。

以上の理由から、矮性種やブッシュ型の品種が植物の選択肢として適しています。第三に、育成するコロニーの種類に応じて、使用するウイルスを宿主として保持できるか、あるいは保持できないかのいずれかである必要があります。ダニ、THP、野生のコナジラミ、またはその他の外来昆虫によってコロニーが崩壊する可能性があるため、選択した品種は他の昆虫を排除できる保護環境下で栽培しなければなりません。

新しいコロニーの最初のコナジラミは、植物ウイルス、他の昆虫、および昆虫病原体が存在しない状態でなければなりません。野外からコナジラミを採集した場合は、少なくとも8週間、ウイルスの非宿主植物で飼育し、その期間中に植物に症状が現れないことを確認してください。清潔なコナジラミが得られたら、吸引または別のソース植物から穏やかに振り落とす方法で、20から100匹を植物が入ったケージに導入します。

毎週、新しいケージを設置する必要があります。最初の3週間は、非ST植物上のコナジラミを使用して新しいケージを設置します。4週目からは、3週間経過したケージから採取した若齢成虫のコナジラミを使用して、次のケージを設置します。

ケージに入れた最初の1週間で、コナジラミは植物の葉の裏側に卵を産みます。2週目には、未成虫のコナジラミが現れ、成虫の一部はまだ生存しています。3週目になると、多くの新しい成虫が羽化し、成虫の個体数が著しく増加します。

これらのコナジラミは、伝播実験に使用することができます。4週目に、羽化後1週間の成虫を新しいケージに移してください。古いケージは撤去し、中の植物は廃棄してください。正確に行ってください。

コナジラミの慎重な転送は、吸引装置と回収 vial を用いて行います。決して無理に吸引しないでください。植物上で吸汁しているコナジラームシは植物に深く潜り込んでおり、無理に引き離すと体が破損し、回収不能になります。コナジラミを回収するために、片手で黄色いプラスチック製のガードをコロニーケージ内に保持しながら、もう一方の手で回収を行います。

植物を軽く叩いて、成虫のコナジラミを飛散させます。コナジラミは黄色いカードに誘引されるため、そこで回収が可能です。アスピレーターを用いて非常に緩やかに吸引し、各回収バイアルに20匹以下のコナジラミを移します。

次に、バイアルを軽く叩いてハエを混乱させ、パラフィルムで蓋をします。ウイルスの伝播を確実にさせるため、ウイルスと宿主植物に応じて、ウイルス感染植物から健全な植物へ15から40匹の若い成虫を移してください。耐性スクリーニングなどの他のプロトコールでは、より多くの開始個体数が必要です。

この場合、コナジラミが付着したウイルス感染植物を、接種が必要な植物の上で揺らしてください。コナジラミをウイルス感染植物に定着させた後、持続的に伝播するウイルスを維持させるため、48から72時間の間、吸汁させてください。一般的に、非持続的または半持続的な方法で伝播するウイルスの場合、時間を長くしても伝播率は向上しません。

特定の葉からの獲得が必要な実験では、1時間から1日という短期間の獲得アクセス期間で十分です。クリップケージを使用する場合、葉の裏面にアクセスできるようにケージを設置してください。また、混雑により伝播率が低下するため、直径2.5 centimeterのケージあたり10匹以上の雌のコナジラミを使用しないでください。植物への接種には、植物の数を考慮して適切なケージを選択してください。

例えば、1株の植物であれば、植物自体よりわずかに大きいだけの小さなケージで十分です。複数株の場合は、小さめのPVCチューブ、フレーム付きケージ、または大きめのアルミニウムフレームケージから選択してください。植物のキャノピー周囲のスペースは、狭ければ狭いほど好ましいです。新しい植物にコナジラミを導入した後、接種に必要な時間は、ウイルスおよび宿主植物によって異なります。

獲得時と同様に、伝播に要する時間は伝播様式に依存します。非永続性伝播は、半永続性または永続性伝播よりもはるかに短いアクセス時間を必要とします。接種アクセス期間中に、コナジラミが刺針または吸汁していることを確認してください。

ケージを開け、各個体のいくつかの葉の裏面を確認します。接種期間が長い場合は、定期的に植物を軽く刺激し、植物体上での再分布を促してください。

これにより、接種期間の終了時にコナジラミが集団化する自然な傾向に対抗し、伝播率を高めることができます。2種類の殺虫剤を順次散布して、コナジラミを駆除します。まず、殺虫石鹸などの接触性殺虫剤を散布し、成虫のコナジラミを速やかに駆除してください。

次に、今後数週間の間に発生するコナジラミを駆除するため、浸透移行性殺虫剤を散布します。残存する成虫に対しては、imidaclopridまたはpyrazineが効果的な選択肢となります。これらの手順を用いることで、日常的に100%のウイルス伝播率を得ることが可能です。このような高い伝播率は、ウイルスの耐性を調べるための試験植物のスクリーニングにおいて不可欠であり、また、ウイルス伝播を阻害する化学化合物の有効性を評価する際にも望ましい条件となります。

このビデオを視聴することで、コナジラミの飼育方法および、それらを用いて植物ウイルスを伝搬させる方法について十分に理解できるはずです。これらの手順は、研究目的やウイルス耐性植物の商業開発、あるいはウイルスの伝搬を阻害する化合物の能評価に利用できます。