ゼブラフィッシュの開発時Photoconvertibleタンパク質を用いた細胞トラッキング
2012年9月28日
本稿では、生きたゼブラフィッシュ胚において光変換性蛍光タンパク質（PCFPs）を光活性化スイッチさせ、さらに発生の特定の時点において光変換されたタンパク質を追跡する方法を提示します。この手法により、生きた脊椎動物個体におけるさまざまな発生過程の根底にある細胞生物学的イベントのモニタリングが可能になります。
この手順の全体的な目的は、生存しているゼブラフィッシュ胚において、光スイッチングされた細胞を追跡することです。これはまず、組織特異的な光変換型蛍光タンパク質を発現している胚を、低融点アガロースに包埋することで達成されます。次に、関心領域内のタンパク質を完全に光変換させます。
その後、胚をアガロースから注意深く取り出し、後期の段階まで28.5 °Cの卵水で維持します。最後に、光変換された胚を再び低融点アガロースに包埋します。最終的に、共焦点顕微鏡により、光変換タンパク質が安定して存在するため、光変換された細胞を後期段階で正確に検出できるという結果が得られます。
本日ご紹介する手法は、細胞生物学および発生生物学の分野において非常に有用であると考えられます。したがって、細胞移動や組織ダイナミクス、その他の細胞挙動の研究において、本手法を活用することは非常に有益であると思われます。光変換性蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換えゼブラフィッシュを交配させた後、本手順の実演を私の研究室のポストドクターであるVeronica Lombardoが行います。
ホモ接合体の中で最も明るい胚を選択し、目的の段階に達した時点で28.5 °Cで育成します。胚を麻酔させるため、卵水を入れたガラス容器の中でピンセットを用いて卵膜を除去します。ガラスピペットまたはカットしたピペットチップを使用し、胚を1つずつtricaに移します。
麻酔した胚を培養皿のカバー上に移し、可能な限り最小量の培地内で保持します。30 °Cに温めた1%低融点アガロース（trica含有）を用いてピペッティングし、胚をアガロース内に移してから、カバーガラス底の培養皿に配置します。アガロースの重合後、滑らかなプラスチックチップを使用して胚の向きを調整します。
405、488、および561 nmのレーザー光源と20倍対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡を用いて、Trica溶液で被覆します。488 nmおよび561 nmのレーザーを使用し、関心領域を含む標本の全構造のZスタック画像を生成します。タイムシリーズツールを選択し、光変換前と後の2サイクルで、インターバルなしに設定します。
領域選択ツールを選択し、光変換のための関心領域（ROI）を1つまたは複数定義します。次に、ブリーチングツールを選択し、スキャン後のブリーチング開始を設定します。ここで使用される2つのうちの1つは、30 milliwatt 405 nanometer ダイオードレーザーです。
レーザー光の強度、関心領域のスキャン回数、およびスキャン速度を調整し、完全な光変換に必要な最小限のレーザー光量になるよう慎重に最適化します。488 nmおよび561 nmのレーザーでサンプルをスキャンし、残存している緑色蛍光および光変換後の光変換性蛍光タンパク質の赤色蛍光を可視化します。光変換後、溶液を捨て、針または滑らかなプラスチックチップを用いてアガロースから胚を慎重に取り出します。
胚を暗所、28.5 °Cの卵水中で、目的の発育段階に達するまで維持します。胚を2回目に包埋し、488 nmおよび561 nmのレーザーを用いて、関心領域を含む標本のZスタックを再度作成します。このプロトコルは正常な発育に影響を与えないため、光変換させた胚を後続の段階で観察することが可能です。
以下は、光変換アッセイの例です。ゼブラフィッシュの受精後48時間から72時間までの発生過程において、血管内皮核にkick Gを発現するトランスジェニックレポーターラインを用いて血管内皮細胞を追跡しました。ここに示されているように、光変換前はkick Gが血管内皮組織に発現しており、488 nmのアルゴンレーザーを用いた緑色蛍光としてのみ検出されました。赤色蛍光を確認するための561 nmレーザーによるコントロールスキャンでは、光変換前に光変換されたkick GRは検出されませんでした。
その後、10%の強度で20回反復し、405 nmダイオードレーザーを用いて関心領域を完全に光変換させ、488 nmおよび561 nmレーザーを用いて頭部血管を再度スキャンした。このパネルでは、後段階で光変換された血管内皮細胞を追跡するため、関心領域内でgreen kick Gが完全に赤色へと切り替わっている。光変換から24時間後（受精後約72時間後）に、光変換された関心領域に由来する血管内皮組織を観察した。
赤色蛍光を発する光変換後のkick Gタンパク質が安定しており、さらに緑色の非変換kick Gタンパク質が新たに合成されたため、非変換および光変換後の両方のkick Gタンパク質が観察されました。この手法により、発生生物学分野の研究者が、複数の魚類における細胞生物学や組織再構築を探索するための道が開かれました。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、光変換可能な蛍光タンパク質を使用して、生きているゼブラフィッシュ胚内での光スイッチされた細胞を追跡する方法を紹介します。この技術により、共焦点顕微鏡を用いて発生過程中の細胞生物学的現象を監視することが可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- 光変換可能な蛍光タンパク質（PCFP）は、特定の細胞の視覚化を可能にします。
- 生きた生物内での細胞イベントの追跡は発生を理解する上で重要です。
- ゼブラフィッシュ胚は脊椎動物の発生を研究するためのモデル生物です。
- 共焦点顕微鏡は生物学的サンプルの高解像度イメージングを提供します。
研究の目的
- ゼブラフィッシュ胚内での光スイッチされた細胞を追跡する方法を開発すること。
- 発生過程中の光変換タンパク質の安定性を監視すること。
- 生きた脊椎動物の発生プロセスの理解を深めること。
使用された方法
- ゼブラフィッシュ胚を低融点アガロースに埋め込む。
- 組織特異的な光変換可能な蛍光タンパク質を発現させる。
- 関心領域でタンパク質を光変換する。
- 発生のために28.5度セルシウスの卵水中で胚を維持する。
主な結果
- 光変換された細胞は後の発生段階で検出できます。
- 光変換タンパク質の安定な存在により、正確な追跡が可能になります。
- 共焦点顕微鏡は光スイッチされた細胞を効果的に視覚化します。
- この方法論は様々な発生研究に適用できます。
結論
- 提示された方法は、生きたゼブラフィッシュ胚内での細胞イベントを追跡するのに効果的です。
- これは発生プロセスと細胞生物学に関する洞察を提供します。
- このアプローチは将来の脊椎動物の発生研究で利用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Cell tracking using photoconvertible proteins enables precise monitoring of cellular dynamics in vivo, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, reproducible data on cell fate and tissue remodeling, enhancing predictive confidence in preclinical models. The method’s applicability to zebrafish—a disease-relevant system—facilitates translational biomarker alignment and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking specific cell populations during morphogenesis.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of protein fate changes in intact organisms.
- Predictive Value: Generates stable, quantifiable readouts for assessing target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, fluorescent outputs compatible with confocal imaging for high-content screening.
- Reproducibility: Ensures consistent photoconversion efficiency via controlled laser parameters and embedding protocols.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and automated microscopy for longitudinal studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Tracks endothelial and other cell types in zebrafish models of vascular and developmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by monitoring cellular events across developmental stages.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights that inform go/no-go criteria for target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven cell tracking, supporting assay development for phenotypic screening, and informing translational research through longitudinal fate mapping.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and target validation by isolating cellular contributions to morphogenetic processes.
- Screening: Generates quantitative fluorescence readouts for compound effect assessment in live embryos.
- Analytics: Delivers stable red/green signal ratios for objective comparison of photoconversion efficiency and protein turnover.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking cellular dynamics to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for tracking multiple cell types across diverse zebrafish transgenic lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in cellular mechanism and target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized embedding, photoconversion, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets via direct cell fate observation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative, mechanism-linked cellular phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, transgenic line maintenance, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to UV/blue laser sources (405 nm) and compatible photoconvertible protein expression systems.
- Necessitates standardization of laser intensity, scan speed, and iteration counts for reproducible photoconversion.
- Requires optimization across tissue types and developmental stages to avoid phototoxicity and ensure signal stability.
- Limited by the need for genetic accessibility and embryonic viability during prolonged imaging sessions.
