自由レーザー回折を用いた微生物水泳の定量的ロコモーションスタディ

この手順の全体的な目的は、自由に遊泳する微生物のスレッシング（激しく身をよじる動作）周波数を測定することです。まず、顕微鏡サイズの線虫のサンプルを調製し、次に光学セットアップを準備することでこれを達成します。

次に、生体 organisms によって導入された回折パターンを記録します。最後に、記録されたデータを解析して泳動頻度を決定します。最終的に、回折解析を用いて、拘束されていない線虫の運動パターンの変化を示します。

従来の顕微鏡観察などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、種が三次元空間を自由に移動する際の遊泳パターンを観察できることです。この方法は、自由に遊泳するC. elegansについての知見を得るのに有用であるだけでなく、さまざまな条件下に置かれた他の透明で小型の微生物にも適用可能です。ビデオ解析に向けてC. elegansを準備するには、まず平らにした白金線ピックを使用して、10から20匹の成体線虫を新鮮なNGM培地へ移動させます。

E. coliを小さな円形のスポット状に塗布したアガー充填ペトリ皿を用意します。線虫に3～5時間産卵させた後、成虫を取り除きます。これにより、50～150匹の発生段階が同調した小規模な培養系を構築します。線虫を若成虫まで成長させるため、ペトリ皿を20°Cで4～5日間インキュベートします。

ビデオ解析の日、1 mLの脱イオン蒸留水を使用して、若成体の線虫のプレートを洗浄し、同期培養から50〜150匹の線虫を回収します。マイクロ遠心分離機を用いて線虫をチューブの底に集めるか、または約15分間、重力で沈降させます。チューブから大部分の水を丁寧に取り除き、1 mLの脱イオン蒸留水に置き換えて、線虫に付着している細菌を洗浄します。

マイクロピペットを使用して、水中の線虫5〜10匹を石英キュベットに移します。ここに示すように光学系を組み立てます。543 nmのヘリウムネオンレーザー、オーバーサンプリング用の2枚の表面アルミミラー（レーザービームをキュベットに導くために使用）、キュベットホルダー、投影スクリーン、および約240 fpsで撮影可能な高速カメラを使用します。次に、パラフィルムでキュベットの上部を覆い、それを反転させて線虫を水柱の中に混ぜ合わせます。

veteをveteホルダーに設置し、線虫が最初はveteの上方に位置するようにします。ミラーを用いて、レーザービームをveteの中心に通します。線虫は水よりも密度が高いため、プロジェクションスクリーン上の水柱の中を泳ぎながら、ゆっくりとveteの底へと沈んでいきます。透過したビームがプロジェクションスクリーンに到達した際の散乱を抑えるため、透過レーザービームに対応するスポットを黒く塗りつぶします。

透過ビームによる散乱を排除または低減させることで、透過ビームに起因するカメラのCCDアレイの飽和を防ぐことができます。回折パターンの大きさを測定するため、回折光の像を妨げないように、投影スクリーン上の透過レーザービームスポットの横に約5 cmの線を引きます。室内灯を消し、線虫がレーザービームを通過する際の回折像をスクリーン上で記録します。

ビデオデータを準備するために、以下のビデオ解析プログラムをインストールし、ビデオをプログラムにインポートします。ソフトウェアを使用して、原点が透過したレーザースポットと一致するように設定します。各線虫によって形成される回折像の角変位を追跡します。

データをスプレッドシートにコピー＆ペーストし、すべての負の角度に180度またはPIを加算して、連続的なグラフを作成します。ビデオ解析装置を用い、投影スクリーンの直前に、回折パターンの中心から外れた位置に、受光面積の小さいフォトダイオードをUSBポート経由で配置します。

フォトダイオードを、コンピュータに接続されたデジタルオシロスコープに接続します。コンピュータの画面上で、スラッシングパターンを観察してください。データを分析するため、データセットをASCIIまたはテキスト形式で保存します。

ビデオまたは写真を使用して、波形のフィッティングが可能なデータ解析プログラムにデータをインポートします。カイ二乗最小化法を用いて正弦波曲線をフィッティングし、スラッシング周波数を決定します。さまざまなサンプルから得られた泳動周波数の平均値を算出し、分散を求めます。

本研究では、単一要因 ANOVA を用いて統計解析を行い、続いて Bonferroni 多重比較検定を実施しました。回折パターンのモデル化において、P 値が 0.05 未満の場合を統計的に有意であるとみなしました。まず、顕微鏡を用いて画像を撮影し、画像を最適化します。

それをMathematicaにドラッグします。BinaryEyesコマンドを使用して、白黒に変換します。あるいは、EdgeDetectコマンドを使用して白黒画像を作成します。この際、後続の2つの数値で、得られるエッジの粗さを制御します。

次に、image dataコマンドを使用して、画像を0と1の行列に変換します。forerコマンドを用いて行列をフーリエ変換し、その後、行列の絶対値の2乗を計算して、結果として得られる画像を確認します。これが元の画像に対応する回折パターンです。さらに、log関数を使用して画像のコントラストを調整します。

最後に、モデルの回折パターンを、自由に泳いでいる線虫から得られた回折パターンと比較します。この例では、幅1 cm、厚さ5 mm、高さ4 cmの石英Q-vetを用いて、C. elegansを解析しました。ビデオ解析を用いて単一の線虫をサンプリングしています。

厚さ5 mmの容器を用いたビデオ解析から得られた平均遊泳頻度は約2.5 Hzでした。同様に、リアルタイムデータ収集法とデジタルオシロスコープを用いて1匹の虫をサンプリングしたところ、遊泳頻度は約2.7 Hzとなりました。この手順は多くの個体に対して繰り返し行うことができます。

自由に泳ぐ線虫の詳細な研究により、5 mmの管内における平均遊泳周波数が2.37 hertzであることが明らかになりました。予想通り、遊泳周波数は這行する線虫の周波数よりも高くなっています。この回折法を用いて、顕微鏡スライド内に閉じ込められたC. elegansの平均遊泳周波数を測定したところ、以前に報告された2 hertzという値と一致することが確認されました。

ビデオに沿って進めます。このビデオで実演した回折パターンのデータ準備とモデリングを用いることで、遊泳時の回折パターンのモデリングが可能になります。一般的な顕微鏡で得られた線虫の画像を用いて、モデリングされた回折パターンから海 elegans の遊泳サイクルをシミュレーションします。

成功したモデルとは、遊泳周波数に一致し、物理的に実現可能な遊泳パターンの成功で構成されます。虫は、遊泳サイクルの終わりにおいて、サイクルの開始時と同じ形状である必要があります。この手法を習得すれば、コンピュータ画面上で遊泳サイクルを観察しながら、高速フォトダイエットを用いることで、1匹あたり1分以内に完了させることができます。

このビデオを視聴することで、自由に遊泳する線虫の評価方法について十分に理解できるはずです。