マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

本実験の全体的な目的は、細胞基板インピーダンスおよびライブセルイメージングを用いて、マトリックス修飾剤に曝露された血管内皮細胞における細胞マトリックス接着の急速な変化をリアルタイムで定量化することです。本実験では、病態生理学的に関連のあるマトリックス修飾剤として、ヘム酵素であるミエロペルオキシダーゼを使用します。まず、表面をフィブロネクチンでコーティングし、接着性マトリックス基板を用意することでこれを実現します。

次に、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）をフィブロネクチンに結合させます。続いて、浮遊させた血管内皮細胞を表面に播種し、フィブロネクチンへの細胞の接着と伸展が最大になるまでインキュベートします。その後、細胞を過酸化水素にさらすことで、MPO介在性のフィブロネクチン酸化を開始させます。

続いて、細胞とマトリックスの接着における急速な変化を、細胞基板インピーダンスおよび生細胞イメージング解析を用いてリアルタイムで定量化します。その結果、NPO介在性のフィブロネクチン酸化によって引き起こされる血管内皮細胞のマトリックス接着の急速な喪失は、細胞基板インピーダンスと生細胞イメージングにより、高い時間分解能でラベルフリーにリアルタイムで定量化できることが示されました。これらの手法の利点は、細胞とマトリックスの接着の変化を高い時間分解能で連続的に定量化できることであり、これにより、マトリックスの修飾が細胞形態や接着依存的なシグナル伝達プロセスの下流での変化をどのように誘導するかについて、重要な新しい知見を得ることができます。

これらのプロトコルは、MPOをマトリックス・ゲーティングやプロテアーゼなどの他のマトリックス修飾剤に置き換えたり、内皮細胞以外の接着性細胞（上皮細胞など）を使用したりすることで容易に適応させることができるため、より広範な意義を持っています。まず、細胞基板インピーダンス測定用の96ウェル金マイクロ電極アレイをコーティングするために、1ウェルあたり 80 µL のフィブロネクチンを加えるか、あるいは生細胞イメージング解析用のガラスボトム細胞培養ディッシュに 2 mL のフィブロネクチンを加えます。アレイまたは培養ディッシュを 37 °C で 2 時間インキュベートします。

次に、表面をブロッキングするため、0.2%BSAを加え、37 °Cでさらに2時間インキュベートします。続いて、HBSSで希釈した精製ヒト my peroxidaseを加え、30分間インキュベートします。その後、HBSSを用いて表面を2回洗浄し、未結合のMPOを除去します。

次に、テキストプロトコルに従って調製した懸濁状態の血管内皮細胞を、1 mLあたり250,000個の密度で、ネイティブまたはMPO含有フィブロネクチンでコーティングされた表面を持つ96ウェル細胞基質インピーダンス微小電極アレイに播種します。35 mmガラスボトム細胞培養ディッシュには、1 mLあたり500,000個の細胞懸濁液を2 mL分添加します。細胞の播種後すぐに、微小電極アレイプレートを37 °C、5% carbon dioxideに設定された細胞基質インピーダンスインキュベーターポートに取り付けます。

そして、ブランク値を測定し、セルインデックスデータの連続取得を開始します。35 mmガラスボトム細胞培養ディッシュを35 °C、5% carbon dioxideインキュベーターに移します。細胞を最大限に接着・伸展させるため、2時間インキュベートします。

インキュベーション後、セルインデックスの読み取りを一時停止し、マイクロ電極アレイプレートを短時間取り出すか、あるいはガラスボトムディッシュをインキュベーターから取り出します。上清を吸引し、温めたHBSSを添加して、阻害剤、MPOモジュレーター、触媒反応、または細胞シグナル伝達阻害剤の影響を検討します。これらを培養系に添加してください。その後、直ちにアレイプレートをインキュベーターポートに戻すか、ガラスボトムディッシュをインキュベーターに戻し、細胞を30分間平衡化させます。

細胞インピーダンス研究のために、NPO触媒による次亜塩素酸依存的なフィブロネクチンの酸化および脱接着を開始するには、マイクロ電極アレイプレートをインキュベーターから取り出し、細胞インデックスの測定を一時停止します。HBSSに過酸化水素を加え、ピペッティングを繰り返して穏やかに混合した後、直ちにマイクロ電極アレイをインキュベーターポートに再装着し、細胞インデックスの読み取りを再開します。35 mmガラスボトムディッシュを用いた生細胞イメージング研究では、インキュベーターからディッシュを取り出した後、63倍の水浸対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡の37 °C加熱ステージに装着します。

また、DIC光学系を用いて、生細胞の動画を記録します。細胞にピントを合わせ、ここで参照されるガイドラインに従ってDIC光学系を最適化してください。DIC動画の記録を開始し、未処理細胞のベースライン値を1分間記録します。その後、過酸化水素を添加し、ピペッティングを繰り返して静かに混合し、顕微鏡のピントを再調整して、必要な時間、処理後の細胞のDIC動画の記録を継続します。細胞基質インピーダンスデータを解析するには、まずデータをスプレッドシートにエクスポートし、細胞接着の解析を行います。

研究では、MPOによるフィブロネクチン酸化の開始直前に記録された値を1としてデータを正規化し、ライブセルイメージングデータを解析するために、正規化された細胞指数を時間に対してプロットして提示します。Image Jなどの画像解析プログラムを用いて、MPOによるフィブロネクチン酸化の開始直前および直後に記録された少なくとも2つの独立したDICライブセルイメージング動画を開き、複数の細胞をランダムに選択し、細胞膜の端を手動でトレースして囲まれたピクセル数を定量化することで、連続するフレームにおける投影面積を測定します。最後に、データを正規化された細胞面積の時間経過によるプロットとして提示します。内皮細胞懸濁液をフィブロネクチンまたはMPO含有フィブロネクチン上に播種すると、細胞基質における細胞指数の値がプラトーに達することから、2時間以内に細胞の接着と伸展が最大になることが分かります。

ネイティブまたはNPO担持フィブロネクチン上で最大細胞接着が確立した後のインピーダンス測定において、NPOが触媒する次亜塩素酸による標的フィブロネクチン酸化（NPOの共基質である過酸化水素の添加により開始）は、細胞-基質インピーダンスおよびここに示すライブセルイメージングで測定される細胞-マトリックス接触表面積の急速な減少を引き起こします。過酸化水素処理に応答してNPO担指フィブロネクチンに結合した血管内皮細胞に認められる急速な細胞脱離は、過酸化水素のみで処理した細胞では認められません。BLEBSstatinによるミオシンIIモーター機能の抑制は、細胞-基質インピーダンスおよびライブセルイメージングで測定される血管内皮細胞の脱離速度を抑制し、MPOが触媒する細胞下マトリックス酸化に応答した細胞脱離および収縮が、アクトミオシンの張力によって駆動されていることを示しています。これらの手法は細胞接着の極めて急速な変化を正確に測定できるため、接着の変化と、ウェスタンブロッティングを用いて並行実験で経時的に測定可能なSARKリン酸化や局在接着シグナリングなどの接着依存性シグナル伝達プロセスの下流での変化との間の因果関係について、重要な知見を得ることができます。