三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

本デモンストレーションの目的は、3Dマトリックス内の生細胞において、蛍光タグ付きタンパク質をイメージングすることです。まず、蛍光タグ付きタンパク質を発現する安定細胞株を作成します。これらの細胞を3Dコラーゲンマトリックスに播種し、共焦点顕微鏡を用いて遊走細胞のタイムラプス画像を撮影します。

最終的に、タイムラプスイメージングとFP解析を通じて、遊走細胞内におけるタンパク質の局在とダイナミクスが明らかになり、3Dかつリアルタイムでタンパク質のダイナミクスと局在を観察することが可能となります。これは、細胞遊走における根本的な疑問を解決するための一つのアプローチとなります。例えば、接着接点は細胞質タンパク質によってどのように制御されているのか、といった点です。

また、これらの接点が特定の阻害剤によってどのように摂動されるかも検討します。P 35ディッシュで細胞を80〜90%のコンフルエンシーまで培養し、メーカーの指示に従ってLipo 2000を用いて目的のプラスミドを細胞にトランスフェクトします。その後、細胞をインキュベーターに入れます。

翌日、細胞を2枚のP1050ペトリ皿に分注し、一晩インキュベートします。培地を補充し、50 µg/mLのG418を添加します。抗生物質選択条件下で2週間、培養を継続します。

培養物を調べ、G418耐性コロニーを確認します。次に、倒立蛍光顕微鏡を用いて、GFP陽性コロニーを同定し、マークします。

細胞をPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、マークした各コロニーが乾燥しないよう、薄い液層を残しておきます。滅菌綿棒でコロニーの縁の可能な限り近いところまで拭き取り、トリプシンを10 µLコロニー上にピペットで加えます。

すべてのコロニーに対して迅速に同様の操作を繰り返します。その後、細胞を剥離させるため、プレートを37 °Cでインキュベートします。顕微鏡下で細胞が球状であることを確認してください。

各コロニーに10 µLのtrypsinを加え、ピペッティングして細胞をプレートから完全に剥離させます。次に、安定したコロニーを増殖させるため、各細胞コロニーを24ウェル培養プレートの単一ウェルに転移します。その後、標準的なウェスタンブロットおよび免疫蛍光染色を用いて、コロニーのタンパク質発現を評価します。

選択した細胞株を、ガラス表面修飾を施した容器で拡大培養します。底面がガラスのディッシュは、コラーゲンの結合に最適です。10 mmの開口部を持つ各P 35ディッシュのガラス部分に、シロ化溶液を300 µLピペッティングします。

室温で1時間インキュベートする。溶液を吸引し、ろ過水で10分間ずつ3回洗浄する。水を取り除き、ディッシュを50 °Cのホットプレート上に1.5時間置く。

乾燥させるため、ディッシュの蓋をわずかにずらして配置します。乾燥したディッシュが冷却した後、各ディッシュのガラス部分に2% glutaraldehyde溶液を300 µLピペットで滴下します。1時間インキュベートし、その後、PBSで10分間ずつ3回洗浄します。

UV照射を1時間行い、ディッシュを滅菌します。まず、100 µLの蛍光トレーサ粒子を遠心分離してペレット化します。上清を捨て、粒子を500 µLの培地で再懸濁します。

5回洗浄を行い、その後、粒子を30 µLの培地で再懸濁します。次に、トリプシンを用いてGFP発現細胞を回収し、1 mLあたり200万個の細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに調製します。成長培地を240 µLピペッティングします。ここに、1 M HEPESを12.6 µL、ろ過水を20 µL、細胞溶液を50 µL、および蛍光粒子を10 µL加えます。

最後に、167 µLのウシ真皮コラーゲン溶液1を加え、十分に混合します。次に、80 µLを準備したシリコナイズ済みディッシュのガラス部分に転移します。ゲルを重合させるため、37 °Cで50分間インキュベートします。

次に、2 mLの増殖培地を注意深く加えます。顕微鏡チャンバーを37 °Cの安定した温度に平衡化し、細胞培地を補充します。DICイメージングにおいて中性pHを維持するため、ディッシュの蓋を、細いパラフィルムを貼ったガラス製のものに交換します。

油浸対物レンズを使用する場合、蒸発を防ぐためにディッシュの側面を覆います。対物レンズの位置に浸漬液を1滴滴下します。ディッシュに入ったコラーゲンゲルを顕微鏡ステージ上に配置し、ディッシュが浸漬液に接触するようにします。

ステージのドリフトを最小限に抑えるため、サンプルにフォーカスを合わせ、イメージング対象となる目的細胞を探索します。ディッシュを約45分間静置させて安定させます。長時間のキャプチャを開始する前に、阻害剤添加実験における画像取得パラメータを指定してください。

目的の作動濃度に薬剤を添加し、補充培地を調製します。中性pHを維持するために細胞培地を補充しますが、perfilで密封しないでください。サンプルを顕微鏡に移し、薬剤処理のタイミングでイメージングを行います。

画像を一時停止し、ディッシュを乱さないように注意しながら、ディッシュの蓋を外します。培地を吸引し、薬剤を含む培地をディッシュにピペットで分注します。その後、注意深く蓋を戻します。

FRAPの最適なセットアップはシステムによって異なります。そのため、必ずメーカーの指示書を確認してください。まず、生細胞イメージングのためのパラメータを設定します。

フォトブリーチング（光退色）用です。練習用細胞を用いてこれらのパラメータをテストし、細胞を損傷させることなく蛍光信号をフォトブリーチングさせるのに十分なレーザー出力を決定してください。次に、サンプルで画像キャプチャを開始し、少なくとも5フレームを取得します。

次に、関心領域を光退色させます。回復時間に合わせて撮影を継続してください。統計解析ソフトウェアを使用して、光退色前後の光退色領域の平均蛍光強度の時間的変化を測定します。

回復曲線を指数関数式に当てはめます。指数近似曲線から、半減期と最終強度のパラメータを求めます。次に、初期蛍光強度に対する最終蛍光強度の比を算出することで、可動分率を求めます。

これらの3D生細胞画像は、GFP標識アクチンを発現している健全な上皮細胞を示しています。4日間の培養後、これらの細胞は3Dコラーゲンマトリックス内で嚢胞を形成しました。一部の細胞は嚢胞の表面に沿って移動し、また別の細胞は嚢胞の内部で移動しました。

遊走細胞によって加えられる牽引力によるマトリックスの変形は、周囲のマトリックスに埋め込まれたトレーサー粒子の変位を通じて解析されます。ここでは、ROキナーゼ阻害が牽引力に及ぼす影響を示しています。トレーサー粒子の動きは、異なる時点の最大投影画像として表示され、各時点が擬似カラーで色付けされています。

あるいは、個々のトレーサー粒子の画像をモンタージュとして表示し、その粒子の動きを示します。時間の経過とともに、このトレーサー粒子は Y 2 7 6 3 2 の添加前および添加後において、それぞれ遊走細胞の後縁に向かって、あるいは後縁から離れるように移動しました。FRAP解析では、3次元マトリックス内を遊走する GFP actin 発現細胞を追跡し、典型的な蛍光回復を確認します。最適化されたレーザー設定での光退色実験後、細胞を健全で損傷のない状態に保ちつつ、関心領域の蛍光強度が背景レベルに比べて目に見えて低下します。

このグラフは、回復曲線を指数関数で近似した結果を示しています。習熟すれば、マトリックスへの細胞播種に1時間で完了します。3-アミノプロピルトリメチルシランを使用する際は、極めて危険であることに注意してください。

そのため、化学薬品用フード内で作業するなど、適切な予防措置を講じてください。また、3Dマトリックス内で細胞を扱う際は、無菌状態を維持することを忘れないでください。