赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境

この手順の全体的な目標は、微小循環中の赤血球凝集体を直接定量化することであり、動的に制御されておらず、一定のせん断速度です。これは、ファーストイントレーニング、赤血球懸濁液、およびリン酸緩衝生理食塩水を含むダブルYマイクロチャネルによって達成され、血液層に一定の歓声を生み出します。2つ目のステップは、ハイスピードカメラで流れを可視化し、記録することです。

次に、画像処理技術を用いて記録を処理し、マイクロチャネル内の平均集計サイズと集計サイズ分布を取得します。最後のステップは、2つの連続するフレーム間のマイクロチャネルに注入された蛍光粒子の変位を追跡することにより、血流速度を決定することです。最終的に、マイクロチャネル内のせん断速度は、血流速度と血液層の厚さに基づいて計算され、凝集サイズを対応する局所せん断速度に関連付けます。

光透過法のような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、赤血球凝集体が他の手法で統計的に分析されるのとは対照的に、微視的なシェアフローで動的に分析されることです。この方法は、赤血球凝集体の形成条件の理解や微小循環における血液放射線学的挙動の発見など、血液放射線分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、幅120ミクロン、高さ60ミクロン、長さ7mmのマイクロチャネルを標準的なフォトリソグラフィー法で作製します。

次に、健康なボランティアドナーから血液細胞を収集し、添付のテキストプロトコルに記載されているように、5、10、および15%ヘマトクリットレベルの赤血球懸濁液を調製し、各赤血球懸濁液の1ミリリットルを蛍光トレーサー粒子を含む1%溶液の60マイクロリットルと組み合わせます。チューブを静かに振って溶液を混合します。また、同量のトレーサー粒子をpH 7.4で1ミリリットルのPBSに組み合わせます。

25マイクロリットルのガラスシリンジに赤血球を含むトレーサー溶液と100マイクロリットルのガラスシリンジを入れます。PBSのトレーサーソリューションを使用して、システムに気泡が存在しないことを確認します。次に、毎秒18フレーム以上を記録できる高速度カメラと微粒子画像速度測定システムに接続された倒立顕微鏡ステージにマイクロチャネルを配置します。

チューブを介して各シリンジをマイクロ流体チャネルの入口ポートの1つに接続し、それらを同じシリンジポンプのホルダーにロードします。シリンジポンプをプログラムして、25マイクロリットルのシリンジを1時間あたり2マイクロリットルの速度で分配します。これにより、100マイクロリットルのシリンジは、サイズの違いにより、その4倍の速度で分注されます。

異なるせん断速度をテストするために、実験間で流量を変更します。20 x レンズを装着したキャリブレーションの嘲笑を使用して、ハイスピード カメラをキャリブレーションします。次に、ポンプを始動して、2つの溶液をマイクロチャネルに分注し始めます。

最適なカメラの露出を決定します。アグリゲートの鮮明なイメージングの時間です。測定値を取得する前に、流れが定常状態に達するのを待つことが重要です。

定常状態になったら、3〜5分以内に到達します。シリンジを補充して混合物を教育し、赤血球を懸濁液に保ちます。定常状態の流れに達したら、赤血球の動きの記録を開始します。

フローを 7 秒間記録します。画像処理が可能なプログラムを使用して、ヒストグラムイコライザー法で撮影した各グレースケール画像のコントラストを強化します。次に、グレースケール画像をバイナリ画像に変換します。

しきい値は、複数の値をテストし、すべてのアグリゲートが適切に検出される値を選択して、慎重に設定します。必要に応じて、1つの骨材内のギャップに対応する穴を埋めます。次に、バイナリ イメージ内の隣接する白いピクセルを決定してセルを検出し、隣接するセルが凝集体として考慮されるようにします。

検出されたさまざまな赤血球凝集体にラベルを付け、バイナリ画像を赤、緑、青の画像に変換して、視覚化を改善します。最後に、赤、緑、青の画像を元の画像にオーバーレイします。画像処理の効率を検証するために、検出されたピクセル数に基づいてフレーム内で検出された各集計の面積を計算します。

すべてのフレームを同じ方法で処理します。次に、各フレームで検出された集計サイズを平均化し、次にすべてのフレームの結果を平均化します。赤血球懸濁液エンジンの各記録の平均集計サイズを取得するには、嘲笑画像を使用して結果を正方形のマイクロメートルに変換します。

次に、1つの赤血球の面積を計算して、代表を決定します。データ取得後の、検出された各凝集体内の赤血球の推定数。ハイスピードカメラを使用して、微粒子画像速度測定システムに使用されるダブルパルスカメラに切り替えます。

ここに示すようなイメージングソフトウェアを使用して、流れの画像取得と速度場の決定のための画像処理を行います。必ず保護メガネを着用してから、レーザーシステムとカメラの電源を入れてください。マイクロメータを顕微鏡の下に置き、得られた画像を使用してシステムを校正します。

次に、流体の流れを開始し、両方の流体の粒子を視覚化します。マイクロチャネルの中面を見つけるには、流れの中で最も速く、最も明るい粒子に焦点を合わせます。次に、フレーム間の時間間隔を約2ミリ秒に設定して、最速の粒子が両方の画像間を5〜10ピクセル移動し、フローの記録を開始するようにします。

画像の前処理に続いています。相関ウィンドウのサイズと形状、および重なり合う画像の割合を選択します。結果を、100 個の画像ペアと速度の二乗平均平方根誤差から計算された平均速度フィールドとして表します。

レーザーカメラとコンピューターの電源を切ります。すべての測定と画像処理が完了したら、まずハイスピードカメラの記録に基づいてマイクロチャネル内の血液の厚さを検出し、推定することにより、純粋な速度を計算します。この目的のために、特定の録画のすべてのフレームを平均化して、ビデオの背景画像を取得します。

最後に、すべてのフレームの平均画像を視覚的に検査し、血液層のエッジを手動で検出して、血液層をデライトします。次に、抽出した速度プロファイルから対応する血液層の厚さの速度値を手動で取得し、速度値を血液層で割ってせん断速度を計算します。ここに示されている厚さは、3つの連続したフレームで検出された4つの赤血球凝集体の正味の動きです。

30個を超えるセルの大きな凝集体は赤で示されています。9 個から 30 個のセルからなる培地凝集体は緑色で示され、9 個未満の細胞からなる小さな凝集体は青色で示されています。凝集体の速度は、示されているマイクロチャネル内の位置によって異なります。

これは、5%ヘマトクリット、10%ヘマトクリット、および15%ヘマトクリットで1時間あたり10マイクロリットルの流量で懸濁した赤血球の速度プロファイルです。予想どおり、両方のエッジで速度がゼロに近づいているのがわかり、全体的なせん断速度が増加すると、各ヘマトクリット レベルの凝集体のサイズが下がるにつれて、2 つの流れの流れの間の変曲点がヘマトクリット レベル間でわずかに変化します。これは、マイクロチャネル内の純粋な力が凝集力を超えるため、赤血球が凝集しなくなるためです。

この手順に参加する際には、マイクロチャネル内のフローの良好な画質を確保し、流れる赤血球と画像の背景とのコントラストを確保することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、制御されたフロー条件下で赤血球凝集体を定性的および定量的に分析する方法を十分に理解できるはずです。