サッカロマイセス・セレビジアにおける新生および成熟転写産物のRNA構造比較解析

共転写RNA処理を研究し、それにはRNAポリメラーゼから生還するRNAの折りたたみ方も含まれます。この方法以前は、合成中のRNAの折りたたみを監視できず、これが研究の妨げとなっていました。この新しい方法はそのギャップを克服しています。

CoSTseqは酵母における新生RNA折りたたみを調査するために開発されました。特に大量のRNAの解析に効果的です。まず、サッカロマイセス・セレビシエ株BY4741を50ミリリットルのYPAD培地に接種し、30度の温度で200回転毎分の振動で培養し、培養が中期ログ段階に達するまで培養します。

約3ミリリットルの酵母培養を採取し、1.8光密度単位に相当し、2,500 x gの遠心分離機を4度の環境で3分間、4度の環境で遠心分離機に置きます。上澄液を廃棄物容器に捨てます。ペレットを冷たいPBS10ミリリットルに再懸浮させ、再び2,500 x gで遠心分離機で4度Cの温度で3分間加熱します。

上清液を取り除き、酵母ペレットは氷の上に保管してください。酵母ペレットを10ミリリットルの冷たい0.5%サルコシルに慎重に再懸浮させ、泡を作らないようにしてください。再懸濁酵母を氷上で20分間培養して浸透させ、その後400 x gで4度の温度で5分間ペレットし、P-1000ピペットを使ってヌクレアーゼフリー水100マイクロリットルに再懸浮させます。

2.5倍の転写バッファーと新たに追加された5ミリモラのジチオスレイトールの作業液を準備し、2.5倍の構造プロービングバッファーを30度Cに予熱します。きれいな2ミリリットルのチューブに必要な反応成分をすべて加え、十分に混ぜます。次に、準備済みの酵母細胞100マイクロリットルを反応管に加え、サーモミキサーで30度に設定し、毎分500回転で2分間振る。

その後、予温された2.5倍構造プロービングバッファーを200マイクロリットルと、同時に硫酸ジメチル試薬25マイクロリットルを加えます。チューブを2回のパルスで優しく渦巻き、インキュベーターに戻す。温度は30度、回転は毎分500回転。サーモミキサーで4分間、サンプルごとに30秒間隔で孵化を続けます。

脱水後は、上澄液を適切な廃棄容器に捨てます。ペレットに冷却したウォッシュバッファーを1ミリリットル加え、再懸浮します。遠心分離を3,500 x gで5分間繰り返します。

すぐにRNA抽出に進み、酵母ペレットは冷凍しないでください。ジメチル硫酸塩標識された酵母ペレットを600マイクロリットルのRNA溶解バッファーに再懸濁させ、その後懸浮液を20%ドデシル硫酸ナトリウム40マイクロリットルのチューブに移します。サンプルを65度Cで30秒間培養し、毎分950回転で振る。

次に、標準手順に従ってRNAのフェノール・クロロホルム抽出を行います。ボルテックスはストレプタビジンの磁性ビーズを形成し、44マイクロリットルのビーズを新しいチューブに移し、1サンプルあたり80マイクログラムの総RNAを含みます。磁気ビーズを磁気ラックに置き、ビーズが落ち着くまで待ってください。

貯蔵バッファーを除去した後、ビーズを1ミリリットルのプリウォッシュバッファーAに再懸濁させます。次に、懸濁液を室温で2分間培養し、その後磁化して上清液を除去します。洗浄後、ビーズを2倍結合バッファーの88マイクロリットルに再懸浮させます。80マイクロリットルの懸濁液を、80マイクロリットルのビオチニル化RNAサンプルを含む無菌1.5ミリリットル管に移します。

ビーズサンプル混合物を室温で回転させて20分間回転させます。その後、チューブを磁気ラックに置き、成熟RNAを含む流れを採取し、沈殿のために保存してDMS-MaPseqワークフローで成熟RNAのポリA選択を行います。次に、ビーズ発生RNA複合体を高塩緩衝液500マイクロリットルで2回洗い流します。

その後、1X結合バッファー500マイクロリットルで一度洗浄し、最後に500マイクロリットルの低塩バッファーで洗浄します。次にビーズ=新生RNA複合体に300マイクロリットルのRNA試薬を加え、十分に再懸濁させて60度のサーモミキサーで5分間培養します。次にクロロホルム60マイクロリットルを加え、ボルテックスして室温で3分間培養します。

サンプルを14,000 x gで5分間、予冷遠心分離機で遠心分離します。最後に、約180マイクロリットルの上部水相を新しい集水管に移します。残った有機相を捨て、ビーズと残留水溶液を残します。

新生RNAを精製した後、テンプレートスイッチング逆転写を行い、5'アダプターを結紮し、シーケンス用のライブラリを選択します。1%アガロースゲル上のテストPCR産物の可視化では、プライマー二量体の形成が最小限で、共転写構造トラッキングシーケンス(CoSTseqおよびDMS-MaPseqライブラリ)で約300塩基対の特徴的なスメアが見られました。CoSTseqサンプル1の電気泳法検査では、約285塩基対のピークでライブラリーサイズ分布が確認されました。

ASC1 mRNAのリードアラインメントにより、CoSTseqライブラリーがイントロン全体にカバレッジを含み、RNAが未成熟であることが確認されました。一方、DMS-MaPseqライブラリはイントロンカバレッジが不足しており、RNAが成熟していることを示しています。18Sのpre-rRNAのcot転写折りたたみ行列は、RNAポリメラーゼがrDNA遺伝子座の位置790から811位に進行する際にDMS反応性が急激に変化することを明らかにしました。

ADH1 mRNAのDMS反応性解析では、新生型と成熟型の間で類似したプロファイルが見られ、構造的安定性領域が示唆されました。対照的に、SSA2 mRNAは新生型と成熟型間で異なるDMS反応性領域を示し、成熟期の構造変化を示唆しました。CoSTseqを用いることで、研究者はin vivoで生前RNAの二次構造やRNA転写物上に位置するRNAポリメラーゼの位置を特定できます。

CoSTseqは時間制限のある手順があり、有害な化学物質を使用しています。一度に2つのサンプルまで処理するのが望ましいです。CoSTseqから生成される総RNAから、非ビオチニル化RNAを従来のDMS-MaPseqを用いた同時成熟構造プローブに利用できます。