結核および多剤耐性結核の診断のためのMODSの方法

世界中の3人に1人が結核に感染しています。活動性結核を診断することは、新たな感染を防ぐことにつながります。なぜなら、活動性結核の患者は、治療を受けるか死亡するまで、年間10人から15人の他の人々に感染させ続けるからです。MODSとは、顕微鏡観察（microscopic observation）、薬剤感受性試験（drug susceptibility assay）の頭文字を取った略称であり、なぜそう呼ばれるかは、手法の説明の中で明らかになります。

この短いビデオでは、結核および多剤耐性結核を迅速かつ安価に診断するためのmods法のメソッドについて概説します。ビデオでは、その手法をステップバイステップで説明します。また、液体培養を用いる際のバイオセーフティ上の留意点と、この手法の使用に必要となる重要な品質保証の問題についても解説します。

modsアッセイは、ペルーのリマにあるカヤナ大学のBob Gilmanの研究室で開発されました。これは、当初loose caviによってなされた観察に基づいています。LOOSEは、比色指示薬を用いて、培養液中のmycobacterium tuberculosisを迅速に検出する方法の特定を試みていました。

しかし、彼女は、比色指示薬が変色する数日前に、顕微鏡下でそれらの培養物を観察すると微量細菌の増殖が認められたことに気づき、その観察に基づいてMOD法が開発されたと述べました。MOD法はリソースが限られた環境で開発され、同様の環境を対象としているため、液体培養ベースの結核検出および多剤耐性検出における1テストあたりの費用は3ドル未満に抑えられています。これは非常に魅力的であり、リソースが限られた地域に初めてこのような診断能力をもたらすものです。

MODSアッセイは3つの中心的な原理に基づいています。1つ目は、mycobacterium tuberculosisが固体培地よりも液体培地で格段に速く増殖することです。これは長年知られている事実です。

第二に、これらの液体培地を顕微鏡下で観察することで、固体培地上のコロニーの肉眼的出現を待つよりもはるかに迅速に myb tuberculosis の増殖を検出できる点です。実際、その増殖は極めて特徴的であるため、液体培地中の M tuberculosis を、細菌や真菌の混入、あるいは存在する可能性のある非定型非結核性マイコバクテリアの増殖から区別することが可能です。最後に、おそらく MGIT アッセイにおいて最も画期的な点は、リファンピシンなどの薬剤を組み込むことで、痰から直接多剤耐性を判定できることです。

これらの薬剤をアッセイの初期段階で使用することで、結核の検出と同時に、その分離株がこれら2つの薬剤に対して耐性を持っているかどうかを判定できます。これにより、継代培養を行い間接的な薬剤感受性試験を作成する必要がなくなります。それでは、modsアッセイの実施に必要な機器について概説します。

調製した培地を保存するために冷蔵庫が必要です。また、試薬とRifampinを秤量するために天秤が必要です。さらに、痰を混合するためにボルテックスミキサーが必要です。

除染液を用いた除染済み喀痰サンプルの濃縮には、3000 Gまで到達可能な遠心分離機が必要です。遠心分離機に冷蔵機能は不要ですが、バイオセーフティ基準に適合し、安全性が確保されていることが絶対条件となります。マイコバクテリウムを取り扱う作業では、遠心機のバケットをロック可能な蓋で密閉できる必要があります。また、37°Cに設定し、その温度を維持できるインキュベーターが必要です。

これはCO2濃縮である必要はありません。modsプレートの読取りには倒立顕微鏡が必要であり、4倍および10倍の対物レンズを備えている必要があります。また、培地の滅菌および細菌培養物の廃棄にはオートクレーブが必要です。培地への分注にはマイクロピペットが必要であり、喀痰検体の取り扱いおよびプレートへの接種を行う操作にはクラス2の生物学的安全キャビネットが必要です。

modsアッセイの実施に必要な試薬は以下の通りです。Middlebrook 7H9培地、カゼインおよびグリセロール、抗生物質サプリメントであるPanta、および栄養サプリメントのOADCです。抗生物質のストック溶液はRifampinであり、リファンピシンの調製にはdimethyl sulfoxide（DMSO）を使用します。また、痰の除染にはsodium hydroxide、sodium citrate、N-acetyl-L-cysteineを用い、リン酸緩衝液の調製にはdi-sodium phosphateとmono-potassium phosphateを用います。感染性廃棄物の処理には10% sodium hypochloriteを、作業面の清掃には消毒剤を使用します。また、以下のプラスチック製品および消耗品が必要です。滅菌済みガラスチューブ、水溶性溶媒用0.2 µmフィルター、有機溶媒用0.2 µmフィルター、マイクロ遠心チューブ、15 mL遠心チューブ、滅菌済み50 mLおよび10 mLセロロジカルピペット、滅菌済みマイクロピペットチップ、24ウェル組織培養用プレート、および痰サンプルを培地に接種した後の24ウェルプレートを収納するための密封可能なZiplocタイプのビニール袋です。

あらかじめ調製しておくことができるストックソリューションが4群あります。リン酸緩衝液は、リン酸ナトリウム、ジバ、およびリン酸一カリウム溶液を組み合わせ、pHを6.8 ± 0.2に調整して作製します。この溶液は滅菌のため121～124 °Cで15分間オートクレーブし、分注して栄養寒天培地で培養することで滅菌を確認します。

これは冷蔵庫（2～8 °C）で最大1か月間保存できます。各痰サンプルには10 millilitersのリン酸緩衝液が必要です。痰の除染用ストック溶液は、水酸化ナトリウムとクエン酸ナトリウムの混合液です。

これらの溶液を等量ずつ混合し、121～124 °Cで15分間オートクレーブ滅菌します。また、2～8 °Cの冷蔵庫で最大1か月間保存することが可能です。客痰サンプル1つにつき、この溶液を2 mL使用します。基本培地は、カスコニとグリセロールを添加したMiddlebrook 7H9培地で構成されています。

7H9粉末を、グリセロールおよびカゼインを含む滅菌蒸留水に溶解し、完全に溶けるまで絶えず攪拌しながら混合します。この培地を121から124 °Cで15分間オートクレーブし、冷却後、滅菌済みの16×100 mmガラスチューブに4.5 mLずつ分注します。培地を37 °Cで48時間培養して無菌状態を確認します。この時間は濁りがないことで無菌であることが示されます。キャップをしっかりと閉めた状態で、2から8 °Cで最大1ヶ月間保存可能です。

各喀痰検体につき、本培地を4.5 milliliters含むチューブを1本使用します。培地用抗生物質のストック溶液は次のように調製します。滅菌蒸留水に完全に溶解させ、水溶性溶媒用の0.2 micrometerシリンジフィルターでろ過します。その後、20 microliterずつ分注して滅菌マイクロ遠心チューブに入れ、minus 20 degrees centigradeで最大6ヶ月間保存できます。20 microliterの分注量1本につき、最大100検体分に十分な量となります。

8 mg/mLのリファンピンストック溶液は、リファンピシンをDMSOおよび滅菌蒸留水に溶解して調製します。この混合物を有機溶媒用0.2 µmシリンジフィルターでろ過し、溶液を20 µLずつ分注して滅菌マイクロ遠心チューブに入れ、-20 °Cで最大6か月間保存できます。20 µLの分注1本につき、最大100サンプルまで処理可能です。それでは、ここから実際の手法について、手順当日に実施すべき3つのステップについて説明します。

ここでは、ストック溶液をワーキング溶液に調製します。まず除染溶液を調製し、次に培地溶液を調製します。最後に、薬剤であるイソニアジドとリファンピンのワーキング溶液を調製します。

mods法に使用される除染方法は、標準化された水酸化ナトリウムNALK除染法です。NALKは粘液溶解薬であり、痰の消化を促進して水酸化ナトリウムによる除染を可能にします。このため、水酸化ナトリウム・クエン酸ナトリウムストック溶液を用意し、その溶液20 mlに0.1 gのNAを添加します。

調製当日に使用しなかった溶液はすべて廃棄してください。培地の最終調製も、使用当日にのみ行う必要があります。保存された7H9培地にOADCとPantaを添加します。各チューブに、培地4.5 mL、OADC 0.5 mL、Panta 0.1 mLを加えて混合します。

これは1検体分として十分な量です。各薬剤の使用液は使用当日に調製し、保存した分注液の活性は保証されないため、使用しなかった溶液はすべて廃棄してください。使用液を、培地7H9 OADCを用いて24ウェル組織培養プレート内で段階希釈し、喀痰検体と培地を添加した後の最終ウェル濃度が、ホリドマイシン（phoric acid）で0.4 µg/mL、リファンピンで1 µg/mLとなるようにします。

次に除染の手順に移ります。2 mLの喀痰検体をコニカルチューブに入れ、2 mLの水酸化ナトリウム除染溶液を加えます。蓋を閉めてしっかりと締め付けた後、懸濁液をボルテックスし、除染が行われるまで15分間静置します。この時間の後、14 mLのリン酸緩衝液を加えます。

蓋を閉めてしっかりと締め、チューブを遠心分離機にかけます。3000 Gで50分間遠心分離した後、上清をデカンテーションで除き、残ったペレットを7H9 OEDC培地の5.1 mLチューブを用いて塗布します。ペレットを約2 mLの容量まで再懸濁させます。この再懸濁サンプルの半分を、バックアップとしてマイクロ遠心チューブに保存します。

これにより、培養物が汚染され、サンプルを再度平板塗布する必要が生じた場合に備えることができます。残りの1ミリリットルを、ガラスチューブ内にある残りの7 H nine oh a DC panterに添加し、これで平板塗布の準備が整ったサンプルとなります。この培地とサンプルの懸濁液を900 µLずつ、24ウェルプレートの1列にある4つのウェルに分注します。

24ウェルプレートの残りのウェルに、以降のサンプルを充填します。5つのサンプルで1枚のプレートを埋めるようにし、5つの列にそれぞれ1つずつサンプルを入れ、6列目はサンプルなしの状態にします。この6列目は陰性対照として機能します。この列には、喀痰サンプル以外のすべての培地成分を添加します。この列で増殖が認められた場合は、明らかにクロスコンタミネーションが発生していることを示しており、プレート全体を廃棄する必要があります。

実行するすべてのプレートに、陰性対照の列が必要です。これで、すべてのサンプルと培地を含むプレートが用意できました。次に、別のプレートに抗生物質懸濁液を添加する必要があります。

前述の手順に従ってリファンピンとIsidの希釈系列を調製し、4チャンネルマルチピペットを用いて、各ウェルから100 µLずつ回収します。次に、2つのコントロールウェルに7H9 OADCを100 µLずつ、また2つの薬剤含有ウェルにリファンピンを100 µLずつ、Isidを100 µLずつ分注します。プレートへの分注が完了したら蓋を閉め、ジップロック袋に入れます。これ以降、袋は二度と開けられないため、液体培地で増殖したあらゆる培養物が袋の外に出ることはありません。

これ以降のプレートの読み取りはすべてバッグ内で行い、バッグはオートクレーブ用バッグに入れて、培養終了後に廃棄します。このようにして、高濃度のマイコバクテリア懸濁液の取り扱いを避けます。それでは、品質管理について簡単に説明します。

modsの手法には、アッセイを適切に使用するために不可欠な品質管理が組み込まれています。まず、陰性対照があり、これはすべてのプレートで実施されます。これについては前述しましたが、要約すると、1枚のプレート上で5つの痰サンプルとともに、痰サンプルを含まないすべての培地成分のみを含む列を設けます。この列のウェルは他のウェルと同様に検査されるべきであり、これらのウェルに増殖が見られた場合は、交差汚染が発生したことを示し、したがってそのプレート上のどの結果も信頼できないことになります。

したがって、プレートは廃棄し、すべてのサンプルを再度播種する必要があります。さらに、陽性対照として機能する内部コントロールがあります。これらは別のプレートで実施され、ラボ内でのクロスコンタミネーションのリスクを最小限に抑えるため、その日の最後に他のすべてのサンプルプレートの準備が完了した後に、このプレートを準備します。

この別のプレートでは、完全に感受性のある mycobacterium tuberculosis 株1株と、isidおよびrifampicinに耐性を持つ株を使用します。プレート上で多剤耐性株を使用することに懸念がある場合は、これら2つの感受性株およびMDR株の代わりに、rifampin単剤耐性株とis単剤耐性株を使用しても構いません。これらの菌株を用いる目的は、培地が菌の増殖を支持していることを証明すること（したがって、すべての陽性コントロールは薬剤を含まないウェルで増殖する必要があります）だけでなく、薬剤濃度が正しいことを確認することです。そのため、感受性陽性コントロールはisおよびRifampinの存在下で増殖せず、耐性陽性コントロールは当然ながらプレート内に存在するRifampinおよびisの濃度に関わらず増殖する必要があります。

それでは、プレートの読判に移ります。サンプラーからプレートに分注した日を0日目とすると、プレートの読判は5日目から開始します。それより前では、マイコバクテリアの増殖が確認されることは極めて稀です。

プレートを倒立光学顕微鏡で観察します。つまり、プレートを下から上に向かって観察することで、コード状の構造を非常に明確に確認することができます。上から培養物を視覚化しようとすると、プレートの蓋に結露が生じるほか、標準的な顕微鏡では焦点距離が不十分であるため困難です。鏡検は一般的に10倍の対物レンズを用いて行い、薬剤を含まない両方のウェルに少なくとも2つのコロニー形成単位（CFU）が認められるものを陽性培養とみなします。

コンタミネーション（汚染）が発生している場合は、培地が混濁し、5日目までには通常、ウェルの大部分で過剰増殖が起こるため、容易に認識できます。対照的に、マイコバクテリアの増殖ではウェルは混濁しません。マイコバクテリアの初期増殖では小さなコンマ状の形態が形成され、それが徐々に進行して、特徴的なコード状（索状）または絡まり状の構造を形成します。2週間以内に、強い陽性増殖が見られる場合はマイコバクテリアの凝集塊が形成され、コード状の構造は主に末端部分で確認できるようになります。

陽性となる培養物の大部分は14日目までに陽性となるため、5日目から14日目までは毎日測定し、その後はラボの業務量に応じて2〜3日ごとに測定することを推奨します。薬剤不含ウェルの2つで培養物が明らかに陽性となった日に、薬剤含ウェルを測定してください。いずれかの薬剤が存在する状態で増殖が見られた場合は、その薬剤への耐性を示します。薬剤不含ウェルで陽性が確認されてから1週間以上経過した後に薬剤含ウェルの判定を行った場合、時折ブレイクスルー増殖が見られることがあるため、それが必ずしも耐性を表しているとは限らない点に十分注意してください。

培養結果が陰性であれば、21日目で判定を終了しても構いません。治療を受けていない患者において、この期間を過ぎて陽性となる例は認められないためです。21日間の培養が完了した後は、培養物を廃棄できます。培養物はZiplocバッグに入れたままオートクレーブ袋に入れ、121～124 °Cで45～60分間オートクレーブ処理した後、安全に廃棄してください。ここで、ペルーだけでなくアフリカやアジアの環境でもMODSアッセイを導入してきた経験に基づき、バイオセーフティとMODSアッセイについていくつかお話しします。

液体培地を用いてマイコバクテリア培養を行う際の安全性およびバイオセーフティについて、繰り返し疑問が寄せられます。液体はこぼれる可能性があり、固体培地にはそのリスクがないこと、またマイコバクテリアの懸濁液を扱う際にはエアロゾル化のリスクがあるため、このような懸念を抱くのは当然のことです。しかし、まさにこれらの理由があるからこそ、MOD法は間接的な薬剤感受性試験を必要とするいかなる方法よりも安全な手法であると私たちは考えています。

その理由は、間接的な感受性試験では、既知濃度の微生物懸濁液を調製する必要があるためです。したがって、これには高濃度の微生物溶液の操作が伴い、それに付随して液だれやエアロゾル化のリスクが生じます。対照的に、これまでご覧いただいた通り、mods法では単に痰の検体をプレートに接種し、その後プレートをプラスチック袋で密封するだけで済みます。

このバッグは二度と開封されないため、これらの高濃度懸濁液を扱う必要はありません。これは、このMOD法が完全に安全であると考えているということではなく、マイコバクテリアの取り扱いには常にリスクが伴います。しかし、2006年に韓国で発表されたデータは、MOD法が他の培養物を平板塗抹することと同等に危険であるに過ぎないという我々の立場を裏付けるものであると思われます。

これは研究室勤務者を対象に行われた研究であり、培養物を塗抹し、薬剤感受性試験の責任を負わない研究室勤務者の職業的リスクは、痰の塗抹鏡検を行う者のリスクよりも大きくないことが示されました。対照的に、マイコバクテリアの懸濁液を扱い、薬剤感受性試験を行う者の結核にかかる職業的リスクは、格段に高いことが分かりました。明らかに、すべての研究室スタッフを可能な限り最大限に保護することが極めて重要であり、したがって、N95規格のマスクに代表される適切な個人用呼吸保護具を着用せずにこれらの手順を一切行わないことを強く推奨します。

さらに、排気エリアすべてがHEPAフィルターでろ過されるクラス2生物安全キャビネットまたはフードが必要です。最後に、研究室内での気流の乱れを防ぐために非常に重要な単純な仕組みとして、検体処理中の人員の出入りを制限するための研究室のドアのロックが挙げられます。これにより、研究室内での伝播リスクを低減できます。以上の説明が、mods法の概要、およびリソースが限られているものの、高品質なTBおよびMDR-TB診断が緊急に必要とされる環境において、この手法がいかに有用であるかをご理解いただく助けになれば幸いです。

詳細については、当社のウェブサイト（mods peru. org）をご覧ください。ここでは、詳細な標準作業手順書（SOP）およびMODSユーザーガイドを掲載しています。肺外検体の処理に関するSOPに加えて、マイコバクテリウム、結核菌、その他のマイコバクテリウム、ならびに細菌および真菌によるコンタミネーションの写真ライブラリも提供しています。また、当社の品質保証戦略や、MODSの導入に向けたラボの認定に推奨される手順についてもご確認いただけます。

最後に、よくある質問集（FAQ）を用意しています。本手法は反復的な改善を前提としているため、現在modを使用しているユーザーからのあらゆるフィードバックを歓迎します。先に述べた通り、これは非独占的な試験であり、他の研究室で実現した改善策には常に強い関心を持っています。