정면 RNA 효소에 의해 지연 복제 포크의 직접 다시 시작

이 실험 절차의 전반적인 목표는 정면 충돌 후 Repli zone 및 RNA polymerase(RNAP)의 운명을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 비오틴화된 DNA 상에 전사 복합체를 조립하고 이를 Stripp 태블릿과 비드에 고정하여, RNAP 신장 복합체가 정지된 상태가 되도록 합니다. 절차의 두 번째 단계는 RNAP 신장 복합체에 미리 준비된 포크형 DNA를 연결하여, 정면으로 마주한 RNAP의 하류에 복제 포크를 형성하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 복제 구역을 조립하고 복제 분기점에서 선도 가닥 합성을 개시하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 자기 비드로부터 DNA를 분리하고 PCR 정제 컬럼을 통해 DNA를 정제하는 것입니다. 최종적으로, 정제된 방사성 표지 DNA 생성물의 알칼리성 아가로스 겔 전개 분석을 통해 roso가 정면 충돌 전사 복합체와 충돌할 때 정지한다는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 로펠러 대학교 Mike O'Donnell 연구실의 Richard Pomerance입니다. 오늘은 고체상에서 리보솜과 RNA 중합효소의 정면 충돌을 유도하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 DNA 상의 전사 복합체가 복제 과정에 어떤 영향을 미치는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작해 보겠습니다. 본 프로토콜을 시작하려면, T7 A1 프로모터를 포함하는 biotinylated 3.6 KB DNA 템플릿과 RNAP holo enzyme을 100 µL의 버퍼 A에 혼합한 후, 이 혼합물을 37 °C에서 10분 동안 인큐베이션하십시오. 10분간의 인큐베이션이 끝나면, RNA 합성이 20개 뉴클레오타이드로 제한되도록 ribonucleotides인 adenosine triphosphate, cytidine phosphate, 그리고 uridine을 첨가하십시오.

정지된 RN ape 신장 복합체를 비드에 고정시키기 위해 해당 용액을 37 °C에서 10분 더 배양합니다. 이 용액을 streptavidin이 코팅된 자성 비드에 추가합니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.

0.9 mL의 고염 농도 버퍼로 비즈를 세척하여 고정된 정지 상태의 RNAP 신장 복합체를 정제하십시오. 매 세척 후 비특이적 R-N-A-P-D-N-A 복합체를 제거하기 위해 자기 분리를 통해 상층액을 제거하십시오. 이 세척 과정을 5회 반복해야 합니다.

그 후 비드를 0.9 mL의 버퍼 A로 두 번 더 세척합니다. 마지막 세척 후, 정지된 RNAP 신장 복합체 하단에 복제 포크를 형성하기 위해 하류 복제 포크를 조립할 수 있습니다. 자석 스트립을 이용해 정지된 RNAP 신장 복합체에 부착된 비드를 100 µL의 New England Biolabs 버퍼 4에 현탁합니다. 다음으로, 10 units의 shrimp alkaline phosphatase 또는 SAP 1을 첨가하고 샘플을 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 비드를 0.9 mL의 버퍼 A로 세 번 세척합니다. 그 다음 비드를 50 µL의 quick T4 ligation 반응 버퍼에 다시 현탁합니다.

2 µL의 quick T4 ligase를 추가하고 포크 형성된 DNA를 미리 준비한 후, 용액을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 마지막으로, 0.9 mL의 buffer A로 비드를 3회 더 세척합니다. hexamer DNA helicase를 정지된 RNAP 신장 복합체 및 하류 복제 포크가 결합된 magnetic strep A 비드와 혼합합니다. 150 µL의 buffer A에서 용액을 준비하고 23 °C에서 30초 동안 배양합니다.

23°C에서 짧게 32회 배양한 후, polymerase three beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P, alpha P 32로 표지된 DGTP 및 alpha P 32로 표지된 DATP를 추가하여 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다. 시료를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.

단일 가닥 DNA 결합 단백질 DCTP와 DTTP를 첨가하여 복제를 개시합니다. 또한, $\alpha$ P 32로 표지된 DTTP와 DCTP를 추가하여 최종 부피를 250 µL로 맞춥니다. 10분 후, 0.5 M EDTA 12 µL를 첨가하여 반응을 종료합니다.

다음으로, strp din 비드를 가열하여 비드로부터 DNA를 분리합니다. 비드를 proteinase K로 50 °C에서 30분 동안 처리하여 잔류 DNA를 제거합니다. 비드를 다시 가열하고 자기 분리를 통해 상층액을 제거합니다.

Kyogen PCR cleanup kit를 사용하여 DNA가 포함된 혼합 상층액을 정제합니다. 마지막으로, 정제된 방사성 표지 DNA 생성물을 알칼리성 아가로스 겔에서 분석합니다. RNAP와 정면으로 충돌하면 보통 2.5 KB 및 3.6 KB 길이의 두 가지 생성물이 만들어집니다. 2.5 KB 생성물은 복제 분기점(fork)부터 정지된 RNAP까지의 DNA 길이를 나타냅니다.

이는 RNAP와 충돌 시 복제 포크가 정지됨으로써 발생합니다. 3.6 KB 생성물은 전체 길이의 DNA를 나타내며, 이는 RNAP가 프로모터를 완전히 점유하지 않았거나 복제 포크가 정면으로 마주 오는 RNAP를 부분적으로 통과하여 읽어냈기 때문에 발생합니다. 양호한 결과는 전체 길이 DNA가 약 50% 생성되었음을 보여줍니다.

하지만 어떤 경우에는 RNAP의 프로모터 점유율이 낮아져 더 높은 비율의 전체 길이 DNA가 관찰됩니다. 이는 정지된 RNAP가 없는 상황에서 더 많은 복제 구역(repli zones)이 정면 충돌 RNAP 복제를 겪지 않기 때문에 결과적으로 전체 길이 DNA만 생성되기 때문입니다. 지금까지 DNA에 결합하여 정지된 RNA 중합효소 신장 복합체가 존재하는 상태에서 복제 및 고체상 실험을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, DNA에 비특이적으로 결합하여 복제를 방해하는 과잉 RNA 중합효소를 제거하기 위해 정지된 전사 복합체를 고농도 염으로 세척하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.