의 DNA Microarrays : 샘플 품질 제어, 배열 하이브 리다이 제이션 및 스캔

이 실험 절차의 전반적인 목표는 자동 믹서 장치를 사용하여 마이크로어레이 실험을 수행하는 것입니다. 이를 위해 먼저 RNA 증폭 및 표지 후 바이오어낼라이저로 RNA 샘플의 품질을 분석합니다. 이후 RNA 샘플을 마이크로어레이에 하이브리드화합니다.

마지막으로, 하이브리드화된 마이크로어레이를 세척하고 스캔합니다. 최종적으로, 이색 형광 마이크로어레이 이미지 분석을 통해 RNA 전사체의 차등 발현을 보여주는 결과를 얻습니다. 마이크로어레이 하이브리드화 단계는 특수 장비가 필요하여 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

품질 관리 분석은 서면 절차에 따라 2, 100 bioanalyzer 기기와 칩 프라이밍 스테이션을 준비하는 것으로 시작합니다. 그다음, RNA 6, 000 nano kit 원심분리기에 제공된 스핀 필터에 550 µL를 피펫팅하여 겔 매트릭스를 여과합니다. 실온에서 1, 500 RCF로 10분 동안 필터를 원심분리합니다.

그 다음 여과된 겔을 65 µL씩 분주하며, 이는 4 °C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 염료 농축액을 10초 동안 볼텍싱한 후, 65 µL 분주액에 1 µL를 첨가합니다. 혼합물을 볼텍싱한 후 여과된 겔을 상온에서 13,000 RCF로 10분 동안 원심분리하여 샘플을 분석합니다.

먼저 프라이밍 스테이션에 칩을 배치합니다. 본 시연에서는 RNA 6,000 nano chip이 사용되었습니다. 검은색 배경에 흰색 G로 표시된 웰에 gel dye mix 9 µL를 로딩합니다.

피펫 팁을 웰의 맨 바닥에 위치시킵니다. 시린지 플런저를 1 mL에 맞추고 프라이밍 스테이션을 닫습니다. 플런저가 클립에 고정될 때까지 천천히 그리고 일정하게 누릅니다.

30초 후에 클립을 풀고 플런저가 몇 초 동안 올라오게 둡니다. 플런저가 멈추면 플런저를 1 mL 위치까지 다시 당기고 프라이밍 스테이션을 엽니다. 9 µL의 겔 염색약을 흡입합니다.

두 개의 웰 각각에서 혼합합니다. Marker G를 표시합니다. 그다음 5 µL의 마커를 래더 웰과 12개의 샘플 웰 각각에 분주합니다. 이어서 변성된 래더 1 µL를 래더 웰에 로딩하고, 변성된 각 샘플 1 µL를 샘플 웰에 로딩합니다.

마지막으로, 사용하지 않은 각 샘플 웰에 마커 1 µL를 첨가합니다. 로딩이 완료되면 칩을 2,400 RPM에서 1분 동안 볼텍싱합니다. 2,100 expert 소프트웨어를 실행한 후, 칩을 배치하고 덮개를 닫습니다.

올바른 포트가 선택되었는지 확인하고, 증발을 방지하기 위해 샘플을 로딩한 후 5분 이내에 분석을 실행하십시오. RNA 증폭 및 표지에 관한 방법은 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 표지 후에는 cogens r an easy mini column을 사용하여 통합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하여 cRNA를 정제하십시오. 그 후 NanoDrop 2000 분광광도계를 사용하여 표지된 cRNA를 정량할 수 있습니다.

마이크로어레이 측정 모드에서 샘플 농도, 수율 및 비활성도를 기록하십시오. 마이크로어레이 하이브리다이제이션을 위해서는 하이브리다이제이션 시작 최소 2시간 전에 수율 825 nanograms 이상, 비활성도 µg당 8 picomoles 이상을 확보해야 합니다. 하이브리다이제이션 스테이션의 전원을 켜고 65 °C로 설정하십시오.

본 프로토콜에서는 Roche NimbleGen 하이브리다이제이션 시스템과 4개의 믹서 챔버를 이용한 Agilent 4x40 4K 어레이의 사용법을 설명합니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로 cRNA 단편화 과정을 수행한 후, 하이브리다이제이션 챔버를 준비합니다. 마이크로어레이 슬라이드의 바코드 면이 조립/분해 도구를 향하도록 배치합니다. 먼저 A4 믹서를 열고, 어레이와 조립/분해 도구를 고정하는 접착제를 노출시켜 움직이지 않도록 합니다.

슬라이드의 맨 끝부분부터 시작하여 A 4 믹서를 배치합니다. 툴에 정확하게 정렬되었는지 확인한 후 어레이를 따라 믹서를 부착합니다. 믹서의 끝부분을 잡고 슬라이드를 당겨 슬라이드 믹서 어셈블리를 제거합니다.

브레이잉 툴(braying tool)을 사용하여 접착 가스켓을 따라 전체적으로 눌러 슬라이드에 단단히 접착되도록 합니다. 접착제와 슬라이드 사이에 갇힌 작은 기포들은 어두운 배경을 통해 확인할 수 있습니다. 브레이잉 툴을 사용하여 이러한 기포들을 제거하는 데 충분한 시간을 할애하십시오.

이제 어레이에 샘플을 로딩할 준비가 되었습니다. 양압 변위 피펫을 사용하여 하이브리다이제이션 샘플 100 µL를 취합니다. 팁을 포트홀 안으로 단단히 밀어 넣은 다음, 어레이 영역에 공기가 갇히지 않도록 천천히 부드럽게 분주합니다.

샘플이 어레이 전체를 덮고 액체가 배출구(vent port)로 나오기 시작하면, 플런저만 놓은 상태에서 피펫을 빠르게 제거하십시오. 팁을 슬라이드에서 뗀 후, 챔버 내부의 샘플이 빨려 나오지 않도록 주의하며 양쪽 포트의 과잉 액체를 부드럽게 닦아냅니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 포트 구멍을 스티커로 덮어줍니다.

슬라이드를 하이브리다이제이션 스테이션에 놓고 블래더 홀이 O-링 위에 정확하게 위치했는지 확인하십시오. 이는 하이브리다이제이션 동안 적절한 혼합이 이루어지도록 하기 위함입니다. 슬라이드 커버와 스테이션 덮개를 닫으십시오.

스테이션을 혼합 모드 B로 설정하고 어레이를 65 °C에서 17시간 동안 하이브리다이제이션합니다. 완료되면 세척 버퍼 1로 표시된 A 유리 접시를 채웁니다. 이때 접시는 어셈블리 분해 도구를 수용하고 어느 정도 조작할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 플라스틱은 화합물을 용출시켜 어레이의 백그라운드를 높이는 경향이 있으므로, 모든 세척 과정은 유리 기구에서 수행해야 합니다.

슬라이드 랙과 마그네틱 바를 염색 용기에 넣습니다. B로 표시한 용기에 랙이 잠길 정도로 세척 버퍼 1을 채우고, 이를 상온의 교반기에 올립니다. 또한, C로 표시한 빈 염색 용기에 마그네틱 바를 넣고 교반기에 올립니다.

하이브리드 스테이션에서 어레이를 제거하여 조립 및 분해 도구에 배치합니다. 한 손으로 조립 및 분해 도구와 슬라이드를 서로 반대편에서 잡은 상태로 전체 어셈블리를 디쉬 a에 담급니다. 어레이 영역에 긁힘이 생기지 않도록 주의하며 A four 믹서를 조심스럽게 벗겨냅니다.

슬라이드를 랙과 염색 접시 B에 빠르게 놓습니다. SCI five 염료는 오존에 민감하므로 공기 노출을 최소화해야 합니다. 중간 속도로 저으며 1분 동안 세척합니다. 염색 접시 C에 미리 데워둔 세척 버퍼 2를 채웁니다.

슬라이드를 옮겨 1분 동안 세척하십시오. 세척 후, 슬라이드에 남는 물방울을 최소화하기 위해 염색 용기 C에서 슬라이드 랙을 매우 천천히 꺼내십시오. 2분 동안 회전시켜 슬라이드를 건조하십시오.

그 다음 슬라이드를 50 milliliter 원추형 튜브에 넣고 argon 가스로 채운 뒤, 신호 손실을 방지하기 위해 Molecular Devices사의 GenePix 4,000 B 스캐너를 사용하여 즉시 스캔합니다. 여기 인간 뇌에서 분리한 4가지 RNA 샘플의 예시가 있습니다. 종양 조직 샘플의 품질은 RNA 6,000 칩이 장착된 2,100 Bioanalyzer를 사용하여 평가되었습니다.

채워진 화살표와 빈 화살표는 각각 18 s 및 28 S-R-R-N-A 종의 위치를 나타냅니다. RNA 무결성 수치 또는 RIN는 RNA 품질의 정량적 측정값입니다. 품질 관리를 위해 바이오분석기로 분석했을 때, 고품질의 전체 RNA 샘플은 두 가지 주요 리보솜 RNA 종에 해당하는 두 개의 주요 피크만을 생성해야 합니다.

일부 RNA 분해는 첫 번째 리보솜 RNA 피크 이전에 스미어(smear) 형태로 나타나며, 심하게 분해된 경우 28 S-R-R-N-A 피크가 현저히 낮게 나타납니다. 저품질 RNA는 낮은 머무름 시간에서 넓은 피크 또는 일련의 피크들을 보일 것입니다. 이때 두 개의 리보솜 RNA 피크는 강도가 매우 낮거나 전혀 식별되지 않을 수 있습니다.

품질이 좋은 어레이는 상대적으로 낮은 PMT 값에서 높은 신호를 생성해야 합니다. 대부분의 전사체는 실험군 샘플과 대조군 샘플에서 유사한 수준으로 존재할 것으로 예상됩니다. 유전자 발현의 광범위한 대규모 변화는 생물학적 유의성이 없을 가능성이 높습니다.

따라서 어레이의 대부분은 녹색이나 빨간색보다는 노란색으로 보여야 합니다. 또한 양질의 신호는 어레이 이미지의 산점도에서 보는 것처럼 신호 히스토그램이 완전히 겹치는 동적 범위 내에 있어야 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 자동 하이브리다이제이션 장치를 사용하여 마이크로어레이 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.