공동 stimulatory 신호 봉쇄와 Alloantigen 자극에 의​​해 사람 말초혈 Mononuclear 세포 Alloantigen 특정 Anergy의 유도

다음 실험의 전반적인 목표는 항원 제시 세포의 CD 28 수용체를 통한 T 세포 공동 자극을 차단하는 항체 존재 하에, 수혜자 동종 항원을 이용하여 수혜자 동종 특이적 공여자 T 세포를 ex vivo로 자극하여 활성화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 두 명의 서로 다른 건강한 공여자로부터 PBMC를 분리합니다. 그 다음, CD 28 자극을 차단하기 위해 B 7.1 및 B 7.2 리간드에 대한 단클론 항체를 처리하여 HLA 불일치 PBMC 집단을 함께 배양함으로써 벌크 동종 활성화 공동 배양 체계를 구축합니다.

그 다음, 동종 활성화(allo energization)의 효능을 1차 및 2차 혼합 림프구 반응(MLR)으로 측정합니다. 마지막으로, 제3자 및 CMV 특이적 반응을 결정하여 동종 활성화의 동종 특이성을 측정합니다. 그 결과, 공여자의 T 세포가 이후의 동종 항원 자극에 대해 저반응성 상태가 되지만, 동종 반응성이 없는 공여자의 T 세포는 손상되지 않고 기능을 유지한다는 점을 확인할 수 있습니다.

우리는 HLA 불일치 줄기세포 이식 도중 및 이후에 동종 활성화 공여자 T 세포를 주입하는 이전 및 진행 중인 파일럿 임상 시험에서 이 전략을 성공적으로 적용하였으며, 처리되지 않은 HLA 불일치 이식 수혜자의 과거 대조군에서 관찰된 것보다 개선된 면역 재구성, 더 적은 감염, 그리고 덜 심각한 급성 및 만성 이식편대숙주질환을 관찰하였습니다. 동종 아노다이제이션 전략의 주요 장점은 이 기술이 병원체 특이적 또는 종양 관련 항원 특이적 T 세포 반응을 감소시키지 않으며, 공여자 T 세포 풀에서 CD4 조절 T 세포를 제거하지 않기 때문에 오프타겟 효과가 최소화된다는 점입니다. 이 절차는 우리 실험실의 스태프 사이언티스트인 Christine Vin이 시연할 것입니다. 첫 번째 단계는 두 명의 건강한 자원자 공여자로부터 혈액을 채취하는 것입니다.

한 공여자의 세포를 반응 세포로, 다른 공여자의 세포를 자극 세포로 사용합니다. 다음으로, Ficoll-Paque를 이용한 밀도 구배 원심분리법으로 혈액에서 PBMC를 분리합니다. Trypan blue로 소량의 세포를 염색한 후, Hemocytometer를 사용하여 생존 PBMC 수를 측정합니다.

각 공여자의 PBMC를 10 mL의 완전 배지에 1 mL당 100만 개의 생존 세포 농도로 각각 별도의 15 mL 원뿔형 튜브에 분주합니다. 대량 동종 활성화 공동 배양을 설정하기 위해 공여자의 PBMC 튜브 중 하나는 자극 세포로, 다른 하나는 반응 세포로 지정합니다.

자극제(stimulator)로 지정된 15 milliliter 튜브에 anti B 7.1 및 anti B 7.2 항체 100 micrograms를 첨가하십시오. 튜브를 부드럽게 흔들어 섞어준 뒤 30분 동안 배양하십시오. 배양 기간이 지나면 자극제 PBMC를 조사(irradiate)하고, 이를 가스 투과성 캡이 있는 T 25 50 cubic centimeter 세포 배양 플라스크에 넣으십시오.

플라스크에 bulk allo coal 배양액이라고 표시하십시오. 다음으로, 다른 공여자의 responder PBMC 10 milliliters(1 million per milliliter, 완전 배지 내)를 플라스크에 추가하십시오. 여기에 antib 7.1 및 Antib 7.2 항체를 각각 100 micrograms씩 더 추가하고 부드럽게 혼합한 뒤, 플라스크를 세운 상태로 인큐베이터에 넣고 72시간 동안 배양하십시오.

다음으로, 차단 항체를 처리하지 않은 벌크 대조군 공동 배양을 위해 또 다른 1,000만 개의 자극 PBMC를 조사한 후, 이를 T 25 50 cubic centimeter 세포 배양 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 벌크 대조군 공동 배양(bulk control coal culture)이라고 표시합니다. 벌크 동종 활성화 공동 배양에 사용한 것과 동일한 반응 PBMC 10 milliliters(1 million per milliliter 농도의 완전 배지 포함)를 플라스크에 추가하고, 플라스크를 인큐베이터에 세워 72시간 동안 보관하기 전에 부드럽게 혼합합니다.

다음 단계는 대량 공배양과 동일한 날에 동종 활성화 공여자 T세포 풀의 기능을 측정하는 것입니다. 측정할 세 가지 시점 각각에 대해 96-웰 플레이트 바닥에 1 U의 primary MLR을 분주합니다. 그런 다음 각 대량 대조군 및 동종 활성화 공배양액에서 5 mL를 취해 15 mL 튜브에 옮깁니다.

다음으로, 각 튜브의 세포 현탁액 200 µL를 3개의 플레이트에 각각 3중 well에 분주합니다. 벌크 대조군 저온 배양 세포가 담긴 well에는 '공동 자극 차단 없음' 또는 'no CSB'라고 표시하고, 벌크 동종 활성화 저온 배양 세포가 담긴 well에는 'CSB'라고 표시합니다. 그런 다음 음성 대조군으로서 각 플레이트의 6개 well에 완전 배지 200 µL를 추가합니다.

마지막으로, 증발을 줄이기 위해 모든 빈 웰에 PBS 200 µL를 추가하고, 대량 공동 배양 설정 72시간 후에 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 측정할 세 가지 시점 각각에 대해 U-bottom 96-웰 플레이트에 secondary MLR이라고 라벨을 붙입니다. secondary MLR을 위한 응답 세포를 준비하려면, 대량 대조군 및 allo-energizing 공동 배양액에서 각각 5 mL를 15 mL 튜브로 옮기고, 상온에서 2000 RPM으로 5~10분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 흡입하고 펠릿을 풀어준 뒤, 각 튜브에 완전 배지 10 mL를 추가하여 세포를 두 번 더 세척하고, 두 번째 세척 후 세포를 다시 원심 분리합니다.

완전 배지 1 mL에 세포를 재현탁합니다. 트라이판 블루 염색을 사용하여 생존 세포 수를 측정하고, 세포 농도를 mL당 생존 반응 세포 100만 개로 조정합니다. 각 튜브의 세포 현탁액 100 µL를 각 플레이트의 3중 웰(triplicate wells)에 분주합니다.

이 웰들을 first party 또는 FP alloy stimulation으로 라벨링하십시오. 그다음 각 튜브의 세포 현탁액 100 µL를 각 플레이트의 다른 3개 웰에 피펫팅하고, 이 웰들을 allo를 위한 first party stimulator PBMC를 제공하는 데 사용된 동일한 공여자의 CD 3/28 stimulation PBMC로 라벨링하십시오. secondary MLR을 위한 stimulator 세포로는 Energized 및 control co cultures를 사용합니다. first party 공여자의 PBMC 10 million개를 1 million/mL 농도로 현탁하고 조사하십시오.

각 2차 MLR 플레이트의 fp allo restimulation으로 표시된 웰에 조사된 자극 세포 100 µL를 넣습니다. 양성 대조군으로는, 각 2차 MLR 플레이트의 CD 3 28 stimulation으로 표시된 웰에 CD3 및 CD28 단클론 항체를 각각 1 µL씩 넣고 완전 배지 98 µL를 추가합니다. 또한, 음성 대조군으로 사용하기 위해 각 플레이트의 빈 웰 6개에 완전 배지 200 µL를 넣고, 증발을 줄이기 위해 모든 빈 웰에 PBS 200 µL를 넣습니다.

플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 다음 단계는 제3자 공여자라고 명명된 새로운 건강한 공여자로 부터 분리한 동종 PBMC의 특이성을 측정하는 것이며, 이는 2차 MLR에서 동종 과정의 특이성을 테스트하는 데 사용됩니다. 제3자 PBMC를 mL당 100만 세포 농도로 부유시키고, 3개의 96-well 플레이트에 분주하여 3일, 5일 및 7일 차에 2차 MLR 특이성을 측정하도록 라벨을 부착합니다.

특이성을 측정하기 위한 2차 MLR용 반응 세포를 준비하려면, 대조군 벌크 공배양액과 동종 활성 공배양액에서 각각 5 mL를 15 mL 튜브에 옮기고 2000 RPM에서 5~10분 동안 원심분리합니다. 그다음 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 펠렛을 풀어준 뒤, 각 튜브에 완전 배지 10 mL를 추가하고 다시 원심분리하는 과정을 통해 세포를 두 번 세척합니다. 세척이 끝나면 세포를 완전 배지 1 mL에 재현탁합니다.

트리판 블루 염색을 사용하여 세포 수를 측정하고, 생존 가능한 responder 세포 농도를 ml당 100만 개로 조절한 다음, 각 튜브의 세포 현탁액 100 µL를 각 플레이트의 3중 웰에 피펫으로 분주합니다. 이 웰들에 TP 또는 제3자 동종 자극(third party allo stimulation)이라고 표시합니다. 그런 다음, TP 동종 자극으로 표시된 웰에 방사선 조사된 TP 자극 세포 100 µL를 첨가합니다.

병원체에 대한 동종 반응의 특이성을 추가로 테스트하기 위해, 이전에 CMV에 대해 증식 반응이 확인된 공여자의 PBMC를 활성화시킨 후 반응을 측정합니다. 96-웰 플레이트를 'secondary M-L-R-C-M-V day three, five and seven'으로 라벨링하고, 벌크 대조군 및 동종 활성화 공동 배양액에서 각각 5 mL를 15 mL 튜브로 옮깁니다. 그 다음 세포를 세척하고 수를 센 후, 완전 배지에서 1 million per milliliter 농도로 재현탁합니다. 각 튜브의 세포 현탁액 100 µL를 각 플레이트의 3개 웰에 분주하고, 해당 웰들을 'CMV stimulation'으로 라벨링합니다.

그런 다음, CMV 자극으로 표시된 웰에 100 µL의 완전 배지에 희석한 CMV 용해물 0.1 µL를 첨가합니다. 이어서 음성 대조군으로서 각 플레이트의 6개 웰에 완전 배지 200 µL를 첨가합니다. 마지막으로, 증발을 줄이기 위해 모든 빈 웰에 PBS 200 µL를 첨가하고 플레이트를 인큐베이터에 넣어 1차 및 2차 MLR에서 증식을 측정합니다.

플레이트를 수확하기 16시간 전에 음성 대조군과 세포가 포함된 웰에 1 µCi의 tritium-labeled thymidine을 추가합니다. TomTec harvester 또는 유사한 장비를 사용하여 플레이트당 하나의 필터 매트에 thymidine을 수집합니다. 필터 매트를 1시간 동안 건조합니다.

그런 다음 각각의 개별 샘플 백에 넣습니다. 각 백에 5 mL의 신틸레이션 용액을 추가하고 밀봉합니다. HLA 불일치 자극 세포와 반응 PBMC를 사용하여, Wallach 마이크로 베타 신틸레이션 카운터 또는 유사 장비로 필터 매트를 읽어 실험 마지막 16시간 동안의 tri thymidine 통합량을 측정합니다.

이 그림을 통해 공자극 차단제(co-stimulatory blockade)가 존재하는 1차 MLR에서는 5일째 반응 PBMC의 평균 동종 증식이 공자극 차단제가 없는 대조군 1차 MLR에서 관찰된 값의 약 30% 수준으로 감소함을 알 수 있습니다. 이는 5일째 1차 동종 증식의 평균 억제율이 약 70%인 것과 동일합니다. 그림에서 확인하실 수 있습니다.

이 그림에서 확인할 수 있듯이, 5일째의 2차 MLR 1차 당사자 동종 증식에서 동종 활성화된 PBMC의 증식률은 일반적으로 대조군 PBMC에서 관찰되는 수치의 10~15% 수준입니다. 이는 평균 85~90%의 증식 억제와 동일하며, 동종 활성화된 PBMC가 1차 당사자 동종 자극제에 대해 저반응성임을 입증합니다. 이 그림에서 보듯, 숙련된 경우 동종 활성화된 공여자 말초혈액 단핵세포의 대량 공동 배양은 2~3시간 내에 설정할 수 있습니다.

이 접근법은 동종 반응성은 낮추면서 병원체 특이적 면역력은 유지한 공여자 T 세포를 생성하기 위해 임상용으로 쉽게 표준화될 수 있습니다. 이러한 세포는 동종 조혈모세포 이식 상황에서 입양 전달되어 과도한 이식편대숙주병 없이 면역 재구성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.

이는 세포의 생존력을 유지하고, 비특이적 활성화 또는 항원 제시 세포의 손실을 방지하는 데 도움이 됩니다. 자극 세포나 반응 세포로 냉동 보존된 PBMC를 사용하는 경우, 생존 세포의 수율을 일관되게 높게 유지할 수 있도록 검증된 냉동 세포 해동 프로토콜을 사용해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면 인간 공여자의 말초혈액 단핵세포를 동종 면역화하는 방법과 이 과정의 효능 및 특이성을 평가하는 분석법 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 전략은 동종 반응이 감소된 인간 공여자의 T 세포를 생성하는 데 활용될 수 있으며, 이는 동종 조혈모세포 이식 후 면역 재구성을 개선하기 위해 임상적으로 사용될 수 있습니다.