원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

다음 실험의 전반적인 목표는 원자 힘 현미경(atomic force microscopy) 마이크로 인덴테이션을 사용하여 신선한 폐 조직의 국소 탄성 특성을 직접 측정함으로써, 상주 세포와 관련된 공간적 규모에서 폐 실질의 국소 기계적 환경을 특성화하는 것입니다. 이를 위해 아가로 팽창시킨 마우스 폐 조직을 면도날이나 메스로 절단하여 길이와 너비가 5 by 5 mm이고 두께가 400 µm인 폐 실질 스트립을 준비합니다. 다음으로 고정되지 않은 비투과 폐 조직 스트립을 면역 염색하여 AFM 마이크로 인덴테이션을 위한 관심 영역을 식별합니다.

그 다음, 실온의 PBS 내에 있는 조직 스트립에 FM 미세 압입 시험을 수행합니다. 신선한 폐 조직의 국소 탄성 특성을 직접 측정하여 결과를 얻습니다. 해당 결과는 정상 폐 실질과 섬유화된 폐 실질의 조직 강성 범위 및 분포에서 뚜렷한 차이를 보이며, 특히 섬유화된 폐 샘플 내에서 강성의 큰 공간적 변동을 보여줍니다.

FM 마이크로 인덴테이션을 사용하여 얻은 강제 변위 곡선에서 추출한 강성 맵을 기반으로 합니다. 조직 스트립 신장과 같은 기존 측정법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전례 없는 공간 해상도를 제공하여 조직 강성의 마이크로 규모 변화에 대한 독특한 관점을 제시한다는 것입니다. 이러한 측정은 조직 내에서 강성이 공간적으로 어떻게 변화하는지, 그리고 질병 상태에서 강성 변화의 범위와 공간적 규모가 어느 정도인지와 같은 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

조직 리모델링을 유도하는 과정입니다. 폐 조직 조각을 준비하기 위해, 먼저 분리된 마우스 폐를 팽창시켜 절단 시 폐 구조가 안정되도록 합니다. PBS로 조제된 2% 저젤점 agarose 용액을 체중 kg당 50 mL의 양으로 기관 내에 주입한 후, 기관을 묶고 4 °C의 PBS 배스에서 팽창된 폐를 60분 동안 냉각합니다. agarose가 공기 공간 내에서 겔화되어 굳어지면서 폐 구조가 부드럽게 고정됩니다. 이 시간 동안 면도날이나 메스를 사용하여 agarose로 고정된 마우스 폐 조직을 길이와 너비가 약 5 by 5 mm, 두께가 400 µm인 조각으로 절단합니다.

그 후 37°C의 PBS에서 5분 동안 스트립을 세척하여 잔류 aros를 제거하고 큰 기도와 혈관을 제외합니다. 큰 기도나 혈관의 이미지를 촬영해야 하는 경우 주기관지에서 더 근접한 폐 조직에서 스트립을 절단하고, 그렇지 않은 경우 주기관지에서 떨어진 늑막하 부위에서 스트립을 절단하여 FM 미세 압입(micro indentation)을 위한 관심 영역을 분리합니다. 위상차 현미경으로 조직을 관찰하거나 면역 염색 후 형광 현미경으로 관찰합니다.

절차에 관한 내용은 본 프로토콜의 서술 부분을 참조하십시오. FM 특성 분석 직전에, 부유 상태의 조직 아래에서 커버 슬립을 들어 올려 조직 스트립을 poly L lysine 코팅된 15 millimeter 커버 슬립에 부착하며, 이때 조직 스트립이 커버 슬립 표면에 고르게 펴지도록 합니다. 필요한 경우, 스트립 위에 깨끗한 무코팅 커버 슬립을 덮고 가볍게 압력을 가하여 조직이 poly L lysine 코팅 커버 슬립에 잘 부착되도록 돕습니다.

각 회차의 미세 압입 실험 직전에 제조사의 지침에 따라 AFM 시스템을 보정하십시오. 이를 위해 두 가지 핵심 파라미터를 결정해야 합니다. 공기 중 열 요동법을 이용한 캔틸레버 용수철 상수와, 포토다이오드 출력 신호를 실제 캔틸레버 굴곡 거리로 변환하는 데 사용되는 파라미터인 캔틸레버 굴곡 감도입니다.

깨끗한 유리 슬라이드 위의 PBS에서 표준 강제 변위 곡선을 얻어 굴곡 민감도를 보정합니다. 그런 다음, 강제 변위 곡선 측정 시 해당 곡선의 기울기를 계산합니다. AFM 팁을 단일 지점에서 시료 표면을 향해 확장 및 후퇴시키며, 팁 변위 delta Z의 함수로서 캔틸레버의 굴곡 delta D를 모니터링합니다. 스프링 상수가 0.06 N/m인 FM 프로브를 사용하여, 직경 5 µm의 실리케이트 구형 팁이 달린 질화 실리콘 삼각형 캔틸레버를 사용할 것을 권장합니다.

우리는 100에서 50,000 pascals 범위의 전단 탄성률을 갖는 연성 재료의 기계적 특성을 분석하였습니다. 조직지로 샘플 커버 슬립의 바닥면을 닦아낸 후, 진공 그리스를 사용하여 이를 표준 유리 슬라이드에 고정하십시오. 유리 슬라이드를 AFM 샘플 스테이지에 장착하고 조직 위에 상온의 PBS 500 microliters를 덮으십시오.

그 다음 샘플 위에 AFM 스캐닝 헤드를 배치합니다. 접안렌즈를 통해 관찰하여 AFM 팁이 시야 중심에 오도록 현미경 샘플 스테이지를 조정합니다. AFM 샘플 스테이지를 이동시켜 조직 내에서 관심 영역을 선택합니다.

그 후 CCD 카메라 뷰로 전환하여 조직의 위상차 이미지 또는 원하는 형광 이미지를 기록합니다. AFM 팁을 천천히 아래로 이동시켜 샘플에 정확히 접촉하도록 합니다. 연성 샘플의 AFM 미세 압입 특성 분석 시에는 국소 변형이 크게 일어나는 것을 방지하기 위해 압입 깊이를 작게 설정해야 하며, 그렇지 않으면 탄성 계수 계산에 사용되는 Hertz 모델이 무효화될 수 있습니다. 큰 변형을 방지하기 위해 캔틸레버의 최대 굴곡(deflection)을 500 nanometers로 설정하여 트리거 모드에서 압입을 수행하십시오.

이 편향 제한은 최대 압입력을 30 nano newtons 미만으로 억제합니다. 압입 속도는 연성 시료의 점탄성보다는 탄성 특성을 탐색할 수 있도록 충분히 느리게 선택해야 합니다. 관심 영역의 단일 측정을 위한 폐 조직의 경우, 2에서 20 micrometers per second의 속도 범위를 선택하십시오.

A FM 프로브를 관심 지점으로 이동시키고 단일 압입을 수행하여 표준 힘-변위 곡선을 수집합니다. 프로브는 Z 방향으로만 이동합니다. 관심 영역의 자동 매핑을 위해 포스 맵 모드로 전환하고, 선택한 영역 내의 스캔 크기와 샘플링 지점을 선택하십시오.

AFM 팁이 압입 동작 사이에 시료 표면을 가로질러 래스터 스캔하며, 정의된 시료 그리드 내의 각 지점에서 개별 힘-변위 곡선을 수집합니다. 20 $\mu\text{m/s}$의 압입 속도로 $80\mu\text{m} \times 80\mu\text{m}$ 영역을 매핑하는 데 $16 \times 16$ 시료 그리드를 사용하는 것이 실용적임을 확인했으며, 이는 약 10분 만에 완료될 수 있습니다. 영률을 계산하려면, 여기에서 보여주는 것과 같이 최소제곱 비선형 곡선 피팅을 사용하여 힘-변위 곡선을 Hertz 구형 압입 모델에 맞춥니다. 여기서 $F = K_c \cdot \Delta D$는 캔틸레버를 굽히는 힘입니다.

K sub C는 캔틸레버 스프링 상수를 나타냅니다. R은 구형 팁의 반경이며, delta는 delta Z에서 delta D를 뺀 값으로 압입 깊이를 의미하며, new는 시료의 푸아송 비로 폐 조직의 경우 0.4입니다. 피팅의 품질을 평가하기 위해 비선형 곡선 피팅 과정 중 데이터와 피팅 값 사이의 차이의 제곱합인 SSR 값을 계산합니다.

SSR 값이 큰 불량 곡선의 데이터를 폐기하여 신뢰할 수 없거나 해석 불가능한 측정값을 제거하십시오. 필요한 경우, 탄성 계수(elastic modulus) 또는 E를 전단 계수(shear modulus)로 변환하십시오. 이때 E = 2(1 + ν)G 관계식을 사용합니다. 포스 맵 모드에서 수집된 강성의 공간적 패턴을 시각화하려면, 예를 들어 80 µm x 80 µm 영역을 커버하는 16 x 16 그리드에 계수 데이터와 컨투어 맵을 플로팅하십시오.

방대한 양의 힘 곡선 데이터를 처리하기 위해, 힘-변위 곡선을 자동으로 피팅하여 탄성 계수를 추출하거나 컨투어 맵 또는 ELA 그래프를 작성하는 맞춤형 알고리즘을 작성할 수 있습니다. 앞서 설명한 것과 동일한 절차와 파라미터를 사용하였을 때, 이 수치는 조직이 적절하게 절단되고 염색되었음을 보여줍니다. 고정이나 투과 과정 없이 기저막 성분인 laminin에 대한 면역형광 염색으로 관찰한 결과, 폐 실질의 폐포 미세구조가 잘 보존되어 있습니다.

이 패널들은 콜라겐에 대한 면역형광 염색 결과를 보여주며, 하나는 PBS로 처리한 쥐에서, 다른 하나는 섬유화를 유도하기 위해 블레오마이신을 처리한 쥐에서 채취한 고정되지 않은 신선한 폐 조직입니다. 동일한 힘을 가했을 때 FM 미세 압입(micro indentation)을 통해 얻은 샘플-변위 곡선이 여기에 제시되어 있습니다. AFM 팁이 부드러운 영역에서는 큰 압입을 생성하여 파란색으로 표시된 상대적으로 완만한 힘-변위 곡선이 나타나는 반면, 더 단단한 영역에서는 작은 압입과 함께 빨간색으로 표시된 가파른 힘-변위 곡선이 나타납니다.

각각의 압입 후에 깨끗한 힘 곡선을 얻으려면, 다음 압입 전에 AFM 팁을 시료 표면에서 완전히 후퇴시켜 접촉이 없는 상태로 만들어야 합니다. 이러한 무접촉 상태는 캔틸레버 변위 없이 팁이 이동하는 곡선의 평탄한 영역에 해당합니다. 이 그림은 평탄한 영역이 없는 전형적인 잘못된 곡선을 보여주는데, 이는 연성 시료가 팁에 달라붙는 경우처럼 팁이 시료 표면에서 완전히 후퇴하지 않았을 때 발생하며, 팁이 연성 시료에 완전히 갇힌 경우 접촉점을 결정하는 것이 불가능해집니다.

곡선은 뚜렷한 굴곡 없이 약간의 노이즈만 있는 형태로 나타날 수 있습니다. 이 그림은 강성(stiffness)을 보여줍니다. 강제 변위 곡선에서 추출된 데이터가 강성 맵으로 공간적으로 표시되었으며, 이를 ELAs graft라고 합니다. 강성에 따라 색상이 변하는 ELAs graft는 정상 폐 실질과 섬유화된 폐 실질의 조직 강성 범위 및 분포에서 현저한 차이를 보이며, 특히 섬유화된 폐 샘플 내에서 강성의 큰 공간적 변동을 보여줍니다.

이 영상을 시청한 후, 원자간력 현미경(Atomic Force microscopy)을 사용하여 신선한 폐 조직의 국소 탄성 특성을 직접 측정함으로써 폐 실질의 국소적 기계적 환경을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.