단백질 막 중첩 분석 : 가용성식이 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 프로토콜 체외에서

단백질 테스트. 단백질 상호작용은 단백질의 기능을 분석하는 데 필수적입니다. 이 영상에서는 수용성 단백질과 막에 고정된 단백질 사이의 상호작용을 테스트하기 위한 인 비트로(in vitro) 단백질-단백질 결합 분석법을 소개합니다.

먼저, 융합 단백질을 클로닝, 발현 및 추출합니다. 태그가 붙은 불용성 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 고정시킨 후, 천연 구조로 재접힘(refolding)되도록 처리합니다. 그런 다음 태그가 붙은 수용성 단백질로 막을 프로빙하고, 면역 블로팅을 수행하여 단백질을 검출합니다.

태그가 붙은 단백질들이 상호작용하면 막에 고정된 단백질에 의해 포착되며, 면역 블로팅(immuno blotting) 신호가 관찰됩니다. 따라서 이 분석법은 불용성 단백질과 용액 내 단백질 간의 상호작용을 테스트하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. GST 풀다운(GST pull down)과 같은 기존 방식과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 불용성 단백질과 수용성 단백질 간의 결합을 인 비트로(in vitro)에서 신뢰성 있게 평가할 수 있다는 점입니다.

이 절차의 첫 번째 단계는 검출을 위해 유전적으로 태그된 단백질을 생성하는 것입니다. 먼저 멤브레인에 고정될 단백질을 클로닝하십시오. 이를 고정 단백질용 pro Im으로 지칭하며, GST와 같은 큰 태그를 인코딩하는 발현 벡터로 클로닝합니다. 태그만 인코딩하는 빈 발현 벡터는 고정 단백질 음성 대조군으로 사용하며, 이를 pro IM nc로 지칭합니다.

다음으로, 수용성 프로브로 사용할 단백질을 strep two와 같은 다른 태그를 인코딩하는 발현 벡터에 클로닝합니다. 이를 수용성 단백질이라는 의미에서 prosol이라 칭합니다. 음성 대조군으로서, 음성 대조군 수용성 단백질을 동일한 발현 벡터에 클로닝합니다. 이를 수용성 단백질 음성 대조군이라는 의미에서 Prosol NC라 칭합니다.

다음으로, 태그가 붙은 단백질을 발현시키기 위해 E. coli 또는 baculovirus와 같은 단백질 발현 시스템을 사용하십시오. 발현 시스템은 번역 후 변형(post-translational modifications) 필요성에 따라 신중하게 선택해야 합니다. 선택한 생물체로부터 발현된 단백질을 추출하십시오. Pro-IM 및 Pro-IMnc Resus에 대하여.

프로테아제 억제제 칵테일이 포함된 SDS page 로딩 버퍼에 세포를 현탁합니다. 그 다음 세포를 5분 동안 가열한 후, 원심분리하여 침전물을 제거함으로써 Prosol 및 prosol NC를 추출합니다. 표준 절차를 사용하십시오. 단백질이 니트로셀룰로오스 막에 고정된 후 재폴딩되므로, pro IMS는 변성 조건에서 추출할 수 있습니다.

하지만, 태그된 단백질이 추출된 후 결합 버퍼에 추가될 것이므로, 천연 상태의 확인을 위해 prosol을 추출해야 합니다. BioRad 단백질 분석 키트와 같은 표준 방법을 사용하여 재조합 단백질의 농도를 결정하십시오. 분석에 정제된 단백질 대신 조추출물이 사용될 경우에 해당합니다.

Kumasi로 염색된 SDS poly acrylamide 겔의 해당 밴드를 스캐닝 밀도 측정법으로 분석하여 표적 단백질의 농도를 추정합니다. 이때 알려진 농도의 BSA를 참조물질로 사용합니다. 그런 다음 BSA의 스캐닝 밀도 측정으로 측정된 신호 강도를 바탕으로 표준 곡선을 작성하고, 조추출물에 포함된 단백질의 양을 계산합니다.

다음 절차 단계는 pro Iam 및 pro IAM NC를 막에 고정하는 것입니다. 먼저 SDS 폴리아크릴아마이드 겔에 pro Iam 및 pro IAM NC 추출물을 각각 1 µg씩 이중으로 로딩하십시오. 전기영동 후 겔을 유리판에서 분리하여 100 mL의 전사 버퍼에 넣고, 실온에서 20분 동안 부드럽게 흔들어 배양하십시오.

배양 후, 웨스턴 블롯을 수행하여 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전이시키고, 전이 후에는 막에 결합된 단백질이 재접힘(refold)될 수 있도록 합니다. 막을 15 milliliters의 버퍼 A에 넣고 부드럽게 흔들어주며 배양합니다. 잔류 SDS를 제거하기 위해 실온에서 15분 동안 부드럽게 흔들어주며 배양합니다.

배양 후 버퍼에서 멤브레인을 조심스럽게 꺼냅니다. 그다음 멤브레인을 25 milliliters의 변성 버퍼에 넣습니다. 실온에서 완만하게 교반하며 2시간 동안 배양합니다.

배양 과정 동안 니트로셀룰로스 막이 불투명해집니다. 그다음, 핀셋을 사용하여 막을 25 milliliters의 TBS로 옮기고 가볍게 흔들어주며 5분 동안 배양합니다. 이 단계에서 막은 원래의 흰색으로 돌아옵니다.

다음으로, 멤브레인을 25 milliliters의 결합 버퍼로 옮깁니다. 4 °C에서 부드럽게 교반하며 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후, 가용성 단백질을 사용하여 멤브레인에 고정된 단백질을 탐지합니다.

먼저, 하이브리다이제이션 버퍼를 준비합니다. 10 mL의 신선한 결합 버퍼가 들어 있는 별도의 튜브에 prosol과 prosol NC를 각각 1~10 µg씩 희석하여 넣습니다. 그다지 버퍼를 하이브리다이제이션 백으로 옮깁니다. 다음으로, 막을 두 개의 스트립으로 자르며, 두 스트립 모두 pro IM 및 pro IAM nc를 포함하도록 합니다.

이 막들을 하이브리다이제이션 완충액에 넣습니다. 각 막을 prosol 또는 prosol NC 하이브리다이제이션 용액으로 옮기고, 완만한 교반과 함께 상온에서 1.5시간 동안 배양합니다. 하이브리다이제이션 용액에서 막을 꺼내어 TBS로 15분 동안 3회 헹굽니다.

단백질-단백질 상호작용을 시각화하기 위해, TBST 내의 2.5% skim milk로 멤브레인을 1시간 동안 블로킹합니다. 인큐베이션 후, 블로킹된 멤브레인을 1차 항체 용액에 넣습니다. 여기서는 anti-strep two polyclonal rabbit antibody를 사용합니다.

부드럽게 교반하며 실온에서 1시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 20 milliliters의 TBST로 15분 동안 세척하고, 다시 실온에서 부드럽게 교반하며 5분씩 두 번 더 세척합니다. 그 다음, 멤브레인을 HRP 결합 2차 항체 용액에 넣으십시오. 여기서는 HRP가 결합된 anti rabbit IgG 항체가 사용됩니다.

실온에서 부드럽게 교반하며 1시간 동안 배양합니다. 20 mL의 TBST로 15분간 막을 헹구고, 이전과 마찬가지로 실온에서 부드럽게 교반하며 5분씩 두 번 더 헹굽니다. 마지막으로 TBS로 헹군 후, HRP 화학발광 기질(Millipore, Molan Western Chemiluminescent)을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 시각화합니다.

HRP 기질은 prosol의 면역 블로팅 후에 사용합니다. 멤브레인을 TBST로 실온에서 15분 동안 한 번, 그리고 5분 동안 두 번 헹굽니다. 그런 다음 pro의 태그에 대한 1차 항체로 멤브레인을 다시 프로빙합니다.

그 후 적절한 2차 항체를 처리합니다. 단백질 막 오버레이 분석에서 얻은 밴드의 정체성을 확인하기 위해 화학 발광을 검출하여 PRO I 및 pro Im NNC를 시각화합니다. 단백질 A와 K, 그리고 YFP와 MP CYFP 사이의 상호작용은 여기에서 보여주는 바와 같이 본 비디오에 설명된 방법을 사용하여 담배 표피 세포에서 평가되었습니다.

생체분자 형광 보완법(biomolecular fluorescence complementation)을 통해 평가한 결과, 강한 YFP 신호가 재구성되었습니다. 이 BFC 신호는 세포 주변부의 Punta에 축적되었으며, MP가 매우 불용성 단백질이라는 점을 고려할 때 이는 세포막의 특징적인 신호입니다. 박테리아 또는 식물에서 발현시켰을 때는, 이러한 상호작용을 검증하기 위해 단백질 막 오버레이 분석법(protein membrane overlay assay)을 채택하였습니다.

1 µg의 GST MP 또는 융합되지 않은 GST를 포함하는 인비트로(in vitro) 단백질 추출물을 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리한 후 니트로셀룰로오스 막으로 전기 전이시켰습니다. 이러한 단백질 샘플을 가용성 a nnk strep two로 프로빙했을 때, 융합되지 않은 GST가 아닌 GST mp에서 결합이 나타났습니다. 또한, 동일한 단백질 샘플 세트를 관련 없는 pro saw nc IE Arabidopsis Cytoplasmic, NADH kinase tagged strep two로 프로빙했을 때는 결합이 관찰되지 않았으며, 이는 A NK MP 상호작용의 특이성을 더욱 입증합니다. 이 절차를 수행할 때, 제시된 프로토콜에 따라 고정화 단백질을 적절하게 다시 채우는 것이 중요합니다.