인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

본 실험의 전반적인 목적은 최적화된 트랜스펙션 및 핵 전달 프로토콜을 사용하여 인간 유도만능줄기세포에서 높은 트랜스펙션 효율을 달성하는 것입니다. 이는 먼저 인간 유도만능줄기세포의 피더 프리 배양법을 확립함으로써 수행됩니다. 트랜스펙션을 위해 인간 유도만능줄기세포를 gelt, TRX 또는 matrigel 위에 하룻밤 동안 도말합니다.

핵전환을 위해 트립신으로 작은 세포 덩어리를 얻은 후, 플라스미드 DNA와 유전자 주입 transfection 시약 혼합물을 플레이팅된 세포에 첨가하고, 플레이트를 원심 분리한 뒤 37 °C에서 배양합니다. 인간 iPS 세포 현탁액을 핵전환 장치에서 핵전환시키고, 세포를 meth 조건 배지에 재현탁하여 37 °C에서 배양합니다. 최종적으로, 인간 iPS 세포에서 높은 transfection 효율을 통한 효율적인 유전자 조작 결과를 얻을 수 있습니다.

이전에 설명된 트랜스펙션 전기천공법 및 핵 주입법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 당사 실험실에서 일관된 결과와 함께 인간 IPS 세포의 높은 트랜스펙션 효율을 일상적으로 달성할 수 있다는 점입니다. 또한 당사의 프로토콜은 유전자 변형 후 세포 사멸을 최소화합니다. 따라서 당사의 프로토콜을 통해 형질전환 인간 IPS 세포주를 신속하고 대규모로 생성할 수 있습니다. 인간 유도만능줄기세포를 무피더 배양에 적응시키기 전에 gelt TRX 코팅 접시를 준비하십시오.

다음으로, 피더 세포에서 배양해 온 인간 IPCs가 담긴 웰에 Accutane 1 mL를 넣고 37 °C에서 1분 동안, 대부분의 세포가 떨어지기 시작할 때까지 배양합니다. 세포에 유리 구슬 10~15개를 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 knockout D-M-E-M-F 12 2 mL를 추가하고 부드럽게 파이펫팅합니다. 세포 현탁액을 10 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

실온에서 800 RPM으로 3분 동안 세포를 원심분리합니다. 인간 iPSC 펠렛이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 튜브를 가볍게 쳐서 세포 펠렛을 부드럽게 분산시킵니다.

Reese, 적절한 부피의 STEM pro 배지에 인간 IPSC 펠렛을 현탁하여 gel TRE 코팅 플레이트의 웰에 분배하십시오. 증식 속도에 따라 인간 IPC는 1:2에서 1:6의 분할 비율로 계대 배양할 수 있습니다. 플레이트를 5% carbon dioxide, 37 degrees Celsius 인큐베이터에 조심스럽게 넣고, 플레이트를 가볍게 흔들어 웰 전체에 세포가 균일하게 분포되도록 하십시오.

세포에 매일 배지를 공급하십시오. 세포 밀도가 80%에 도달하면 새로운 겔로 다시 계대 배양할 준비가 된 것입니다. 최적의 형질전환 효율을 달성하기 위해서는, 형질전환 당일 1:2 분할 비율로 Rex 코팅 웰에 분주한 세포의 밀도가 약 40~50%여야 하며, 작은 콜로니 형태로 겔 코팅 웰에 고르게 분포되어 있어야 합니다.

이 절차를 시작하려면, 멸균된 1.5 milliliter eend orph tube에 100 µL의 knockout medium을 준비합니다. 27 µL의 gene juice transfection reagent를 넣고 잘 섞은 후, 상온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 4 µg의 plasmid DNA를 추가합니다.

최적의 transfection 효율을 위해서는 플라스미드 선택이 매우 중요합니다. 본 실험에서 사용된 플라스미드는 인간 IPC에서 전사 활성이 강한 CAG 프로모터에 의해 구동되는 enhanced green fluorescent protein을 포함하고 있습니다. 튜브를 상온에서 15분 동안 배양하십시오.

15분 후, gene juice DNA 혼합물을 세포에 첨가하고 플레이트를 흔들어 섞어줍니다. 웰 내의 인간 IPC와 transfection 혼합물의 접촉을 높이기 위해 플레이트를 1,200 RPM으로 5분간 회전시킵니다. 세포를 37 °C에서 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다.

핵 transfection 효율을 모니터링하기 위해, 핵 transfection 당일에 인간 IPC를 10 µM ROCK inhibitor로 37 °C에서 최소 1시간 동안 전처리합니다. 인간 iPSCs가 전처리되는 동안, 멸균된 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 인간 줄기세포 핵 effector 용액 82 µL를 준비합니다. 80 µL를 첨가합니다.

보충제 1을 넣고 피펫팅하여 잘 섞습니다. 용액을 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 미리 준비한 피더 세포 조건화 배지와 0.25% Trypsin-EDTA를 후드 내에서 37 °C로 예열합니다.

멸균된 15 mL 원추형 튜브 하나에 라벨을 미리 붙입니다. 핵 전환을 진행할 인간 iPSC 배양액에서 배지를 조심스럽게 제거하고, 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 세척합니다. PBS를 흡입하여 제거한 후 트립신을 첨가하고 37 °C에서 3분 동안 세포를 배양합니다.

성공적인 핵 형질전환을 위해서는 세포를 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하지 않는 것이 매우 중요합니다. 대신, 세포를 2~3개의 세포로 구성된 작은 덩어리로 분쇄해야 합니다. P 1000 피펫 팁을 사용하여 세포를 부드럽게 파이펫팅함으로써 2~3개의 세포로 구성된 작은 덩어리로 만듭니다.

반복적인 피펫팅으로 웰 바닥을 세척하여 모든 인간 IPC가 완전히 분리되었는지 확인합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 라벨이 부착된 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 9 milliliter의 마우스 배아 섬유아세포 배지를 추가합니다.

트립신을 불활성화하려면 세포를 800 RPM에서 3분 동안 원심 분리하십시오. 세포 펠릿이 손상되지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거하십시오. 그 다음, 세포를 100 µL의 예열된 인간 줄기세포 핵 추출 용액에 현탁하십시오.

1 mL 피펫 팁을 사용하여 세포를 핵 효능제 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액에 4 µg의 플라스미드 DNA를 첨가하고, 가볍게 돌려 섞어 세포와 DNA를 혼합합니다. 튜브를 후드 표면에 두 번 가볍게 두드립니다.

vete를 핵 전이 장치의 핵 전이 홀더에 삽입합니다. 버튼 x를 눌러 프로그램 B 0 1 6 핵 전이 세포를 선택합니다. 보통 1~5초가 소요되는 핵 전이 과정이 완료되면 Okay가 표시됩니다. 핵 전이 키트에 제공된 플라스틱 파스따 피펫을 사용하여 vete에서 핵 전이된 세포를 회수합니다. 멸균된 1.5 milliliter eend orph에 미리 데워둔 CM 및 rock inhibitor를 넣어 세포를 재부유시켜 회수합니다. 세포를 37 °C에서 10분 동안 배양합니다.

10분 후, 1 mL 피펫 팁을 사용하여 세포를 피더 층(feeder layers) 위에 한 방울씩 옮깁니다. 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날에 확인합니다. 형질전환 효율을 모니터링합니다.

여기에는 Gene Juice를 사용하여 transfection한 후 12시간이 지난 EGFP 발현 RIV one 인간 IPSC 세포의 광현미경 사진이 제시되어 있습니다. Gene Juice와 강력한 프로모터를 사용한 인간 IPC의 플라스미드 DNA transfection은 일시적 transfection 분석에서 일반적으로 60% 이상의 EGFP 리포터 발현 세포를 생성합니다.

EGFP 발현 세포는 핵 transfection을 통해 얻을 수도 있으며, 이는 B 0 1 6 핵 transfection 프로그램 또는 A 0 2 3 핵 transfection 프로그램을 사용하여 핵 transfection 후 피더 세포 위에서 배양 및 형성된 RIV one 인간 IPCs의 이미지에서 확인할 수 있습니다. B 0 1 6 프로그램을 사용하면 EGFP 양성 세포가 최대 80%까지 나타나지만, A 0 2 3 프로그램에서는 EGFP 양성 세포가 10% 미만으로 나타났습니다. 또한, 트랜스진을 발현하는 형질전환 인간 iPSCs의 안정적인 클론을 유도할 수 있습니다.

gene juice로부터 유래하여 유비쿼터스 EGFP 발현을 보이는 안정적인 EGFP 발현 인간 IPSC 콜로니의 예가 여기에 제시되어 있습니다. 이 세포들은 배아체 분화 과정 동안 지속적인 EGFP 발현을 유지합니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 IPS 세포를 핵효과 및 형질전환 시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

효율적인 유전자 조작은 줄기세포 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 필수적인 도구이며, 재생 의학에서 인간 iPS 세포주의 활용을 가속화할 것입니다.