불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

이 절차의 전반적인 목표는 불연속 페랄 수크로스 밀도 구배(discontinuous peral sucrose density gradient)를 사용하여 마우스 뇌 피질로부터 번역 활성 시냅스 신경 구역(translationally active synap to neuro zones)을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 피질을 수집 및 균질화한 다음, 균질액을 원심 분리함으로써 수행됩니다. 그 후, 원심 분리된 균질액 또는 상층액을 미리 준비된 페르코 수크로스 구배(per co sucrose gradients)에 적용합니다.

마지막 단계는 원심분리를 통해 시냅토솜 분획을 수집하는 것입니다. 최종적으로, 웨스턴 블롯 분석과 S 35 메티오닌 통합 실험을 통해 시냅토솜 분획이 시냅스적으로 농축되어 있으며 번역 활성이 있음을 확인합니다. 원심분리 및 여과와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 첫째, 밀도 구배를 활용함으로써 기계적 손상을 방지할 수 있다는 점이며, 둘째, Percoll은 세포 및 그 구성 성분에 대해 독성이 낮다는 점입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 타이밍이 매우 중요하기 때문에 이 프로토콜을 수행하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 피질을 수확한 후에는 절차를 신속하게 완료해야 합니다. 절차를 시작하려면, 동반된 원고에 설명된 대로 GM 완충액에 각각의 SIP 양을 첨가하여 3, 10, 15, 23% 농도 구배 층을 준비하고 잘 혼합하십시오.

캡이 닫힌 Beckman 원심분리관에 15%, 10%, 3% 등삼투성 perol 용액을 각각 2mL씩 피펫팅하여 농도 기울기 층을 만듭니다. P 1000 피펫을 사용하여 층 간의 경계가 층 섞임 없이 명확하게 구분되도록 해야 합니다. 제작된 농도 기울기는 사용 전 4°C에서 최소 20분 동안 보관하십시오.

이 절차를 시작하기 전에, 동반된 원고에 설명된 대로 필요한 다른 용액들을 준비하십시오. P 13에서 P 21 연령의 마우스를 안락사시키고, 목 뒷부분과 머리에 70% ethanol을 뿌려 해부 준비를 합니다. 그 다음, 날카로운 가위를 사용하여 두개골 기저부의 척수를 절단하십시오.

다음으로, 두개골 상단의 피부를 제거합니다. 두정골과 두정간골 사이, 또는 대뇌와 피질 영역 사이의 두개골을 측면으로 절개합니다. 그 후, 시상봉합선을 따라 기저부에서 코 방향으로 두개골을 절개합니다.

이 단계에서, 각 반구를 옆으로 당겨 부드러운 두정골을 조심스럽게 제거합니다. 그 후, 소뇌 위쪽의 뇌에 스패튤라를 삽입하여 피질을 긁어냅니다. 이를 얼음처럼 차가운 GM 버퍼에 넣고, 더 많은 피질을 수집하기 위해 동일한 절차를 반복합니다.

이제 피질을 얼음처럼 차가운 GM 완충액으로 헹굽니다. 그 다음 피질 두 개를 5 mL의 차가운 GM 완충액이 들어 있는 유리 호모게나이저로 옮깁니다. 느슨한 페스틀인 페스틀 A로 5~10회 부드럽게 균질화한 후, 타이트한 페스틀인 페스틀 B로 5~10회 균질화합니다.

스트로크 횟수는 사용되는 균질기마다 다릅니다. 균질화된 시료를 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 이를 1000 ×g에서 원심분리합니다.

Allegra 6 KR 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 10분간 원심분리하여 세포 파편과 핵을 펠렛화합니다. 각 페락소스(peroxisome) 또는 수크로스 밀도 구배당 2 mL의 상층액을 층층이 쌓고, 전체 피질 하나당 구배 하나를 배정하여 튜브의 캡을 닫습니다. 그다음 Beckman J 2-21 원심분리기의 고정각 로터를 사용하여 4 °C에서 32,500 ×g로 5분간 원심분리합니다.

완료 후 적절한 어댑터를 사용하여 구배를 형성하면 강한 SN 밴드가 나타나야 하며, SN 밴드 위의 용액을 피펫으로 빨아내어 폐기합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 15~23% 계면에 있는 SN 밴드를 추출하며, 일반적으로 하나의 구배에서 약 0.9~1.1 mL의 SN이 얻어집니다. 그 후, 이를 원추형 튜브로 옮겨 얼음 위에 보관합니다.

그 다음, 10배 농축 자극 완충액을 1/10 부피만큼 첨가하여 SNS의 염 농도를 조절합니다. 선택 사항으로, 최종 농도가 12 nM이 되도록 1000배 농축 염화칼슘을 첨가합니다. 다음으로, 비특이적 흥분을 억제하기 위해 최종 농도가 1 µM이 되도록 1 mM TTX 스톡을 첨가합니다.

다음 단계는 단백질 번역 연구와 같이 적절한 다운스트림 애플리케이션에 SNS를 사용하는 것입니다. 다른 애플리케이션의 경우, Pierce SDS page sample prep kit를 사용하여 SN 용해물을 정제하거나 농축할 수 있습니다. SNS의 단백질 농도는 micro BCA protein assay kit를 사용하여 결정할 수 있습니다.

여기에 6개의 밴드 또는 분획의 예가 있습니다. 마우스 대뇌 피질을 균질화하여 불연속 퍼콜(percoll) 설탕 농도 구배로 분리했을 때, 농축된 SNS는 23%에서 15% 사이의 계면에 위치한 밴드 5에 포함되어 있었으며, 이 밴드를 제거하여 전자 현미경으로 관찰하였습니다. 온전한 시냅스 소포의 예와 시냅스 전 및 후 요소의 보존 상태가 여기 웨스턴 블롯에 나타나 있습니다.

불연속 sucrose 구배 원심분리법의 SN 밴드에서 시냅스 마커의 증가와 불순물의 감소는 글루타메이트 첨가 시 S 35 methionine의 통합 증가가 단백질의 de novo 합성에 의한 것임을 확인시켜 줍니다. 단백질 합성 억제제인 40 micromolar anesa mycin을 첨가하였습니다. 이 그림은 글루타메이트의 존재 여부와 관계없이 anso mycin이 있을 때, 기저 수준과 비교하여 S 35 methionine의 통합이 현저히 감소함을 보여줍니다.

따라서, 불연속 펄(peral) sucrose 구배법을 이용하면 단백질 번역 연구에 사용할 수 있는 활성이 높고 상대적으로 순수한 SNS를 빠르게 제작할 수 있습니다. 이 그림은 불연속 펄 sucrose 구배의 5번 밴드에서 de novo 단백질 합성이 가장 높은 수준으로 나타남을 보여줍니다. 균질화된 피질을 공극 크기가 점차 감소하는 일련의 필터를 통해 통과시킨 후 불연속 펄 sucrose 구배로 원심분리하여 준비한 SNS는, 비교 대상인 불연속 펄 sucrose 구배법으로 준비한 SNS보다 파손된 막이 더 많이 포함되어 있고 온전한 SNS는 더 적게 포함되어 있습니다. 불연속 펄 sucrose 구배법을 사용하여 준비한 SNS는 여과법을 사용하여 준비한 SNS보다 더 높은 de novo 단백질 합성 활성을 갖는 것으로 나타났습니다.

젊은 생쥐에서 준비된 SNS는 고령의 생쥐보다 더 높은 번역 활성을 갖는 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 생쥐의 대뇌 피질을 균질화하고, 스윙 버킷 로터를 사용하여 균질액을 원심분리하며, 고정각 로터에서 퍼콜 sucrose 구배를 통해 상층액을 원심분리한 다음, 결과로 생성된 시냅스 뉴로존 밴드를 수집함으로써 번역 활성 시냅스 뉴로존을 분리하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.