에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans

이 절차의 목적은 RNAi 기반의 게놈 스크리닝과 형광 표지 단백질을 이용하여 C. elegans의 단백질 발현 및 위치 결정에 관여하는 배아 이후 조절 인자를 식별하는 것입니다. 적절한 스크리닝 균주가 구축되면 RNAi 라이브러리를 선택합니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 라이브러리 클론을 박테리아에 패키징하는 것입니다.

그 후 박테리아를 선택하여 배양한 다음, 단계별로 분절된 C. elegans 선충에게 먹이로 제공합니다. 선충을 72시간 동안 성장시킨 후, 관심 있는 표현형의 변화가 있는지 관찰합니다. 최종적으로, 표적 단백질의 발현 또는 세포 내 국소화의 변화를 형광 현미경으로 시각화합니다.

이 방법은 형광 표지된 단백질의 적절한 세포 내 국소화를 위해 필요한 유전자를 식별할 수 있습니다. 하지만 이 프로토콜은 관심 있는 다른 포배기 이후의 표현형에 영향을 미치는 유전자를 식별하도록 수정될 수 있습니다. 기존에 발표된 프로토콜과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 배양 전 박테리아에서 이중 가닥 RNA의 생성을 유도함으로써 동물 내 RNAi 반응의 수준과 일관성을 최적화했다는 점입니다.

본 절차의 시연은 저희 실험실의 연구원인 Kathy fuss가 진행하겠습니다. 실험 시작 후 2개월 이내에 클론 라이브러리를 준비하십시오. 먼저 선택된 피딩 라이브러리 클론과 양성 및 음성 대조군을 LB 카르보닉 테트라사이클린 플레이트에 스트리킹하십시오. 양성 대조군으로는 BLE four와 같이 용량 의존적 포배기 표현형을 생성하는 유전자를 포함하는 클론을 사용하십시오. 음성 대조군으로는 빈 벡터 또는 관찰된 표현형이 없는 예측 가유전자를 포함하는 클론을 사용하십시오.

플레이트를 하룻밤 동안 배양한 후, 각 클론에 대해 스트리킹 플레이트의 단일 콜로니를 50 µg/mL의 카보닉산이 함유된 2 mL LB 배지에 접종합니다. 배양액을 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침 용액이 탁해지면, 배양액에 IPTG를 첨가하여 이중 가닥 RNA의 생산을 유도하고 동일한 조건에서 4~5시간 더 배양합니다.

IPTG를 첨가하면 NGM 플레이트의 IPTG와 오거(auger)에만 의존하는 것보다 유전자 산물의 RNAi 유도 녹다운(knockdown)을 더 일관되고 강력하게 보장할 수 있습니다. IPTG 배양 후, 각 클론의 배양액 30 µL를 준비된 24웰 NGM RNAi 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 웰당 하나의 클론을 배정합니다. 각 플레이트에는 대조군을 위한 두 개의 웰이 포함되어야 합니다.

각 라이브러리의 위치를 주의 깊게 표시하십시오. 24웰 플레이트에 클로닝한 후, 플레이트의 덮개를 연 상태로 멸균 층류 후드(flow hood) 내에서 약 20분 동안 건조시킵니다. 이때 한천(agar)의 가장자리가 플레이트에서 떨어지지 않도록 주의하십시오.

플레이트에 단계별로 구분된 선충을 건조시킨 후, 선충 준비 과정에 대한 지침이 제공됩니다. 다음 섹션에서는 1단계 유충 또는 L1 단계 선충 집단으로 시작하십시오. L1 유충으로 시작하면 잠재적인 배아 치사 표현형을 피할 수 있습니다.

스크리닝을 위해 단계별로 구분된 동물 집단을 보유하면, 관찰된 변이가 단순히 각 단계에서 발생하는 일반적인 변이가 아니라 RNAi에 의한 것임을 더 확신할 수 있습니다. 하지만 RNAi로 인해 발달 지연이 발생하는 경우, 스크리너는 이를 기록해야 합니다. 스크리닝 균주의 혼합 단계 집단입니다.

난각으로 보호된 배아만이 이 단계에서 살아남을 것입니다. 20 °C에서 수행할 경우 12시간 이내로, 또는 박테리아 배양액을 접종하는 날 16 °C에서 수행할 경우 18시간 이내로 동물을 단계별로 구분하십시오. 건강하고 임신한 성체와 배아가 모두 포함된 스크리닝 균주 동물이 들어 있는 100 mm 플레이트 3개를 선택하십시오.

모든 동물을 멸균된 M nine 배지로 세척하고, 세척액을 스크류 캡이 있는 멸균된 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 세척액이 3.5 milliliters보다 많으면, 동물을 원심 분리하고 액체를 3.5 milliliters만 남기고 모두 제거합니다. 3.5 milliliters보다 적은 경우

물 또는 M9 배지를 사용하여 부피를 3.5 milliliters로 늘려 성체로부터 배아를 분리하며, 각 세척 단계마다 수산화나트륨과 표백제 혼합액 1.5 milliliters를 첨가합니다. 이 용액 내에서 동물이 배양되는 시간은 10분 이내가 되도록 합니다. 타이머를 시작한 후 각 튜브를 10초 동안 볼텍싱하고, 2분마다 볼텍싱을 반복합니다.

매번 볼텍싱(vortexing)을 수행한 후, 해부 현미경으로 용액 내에 성체 사체가 있는지 관찰하십시오. 6~8분 이내에 성체는 분해되고 배아가 방출됩니다. 원심분리를 통해 배아를 펠렛(pellet) 형태로 모은 다음, 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 최대한 제거하여 표백액으로부터 배아를 분리하십시오.

그 다음, 멸균된 M nine을 첨가하고 교반하여 펠릿을 10 milliliters 부피로 다시 현탁합니다. 표백제 냄새가 완전히 사라질 때까지 이 세척 과정을 최소 한 번 더 반복하십시오. 동물의 단계를 더 엄격하게 조절하려면, 먹이가 없는 M nine 배지에서 배아를 부화시켜 L1 단계에서 성장을 멈추게 하십시오.

M nine 배지에 있는 배아를 작은 삼각 플라스크로 옮겨 이 과정을 수행합니다. 해당 균주와 실험에 적합한 온도에서 플라스크를 하룻밤 동안 흔들어 줍니다. 이 과정 동안 동물들이 모두 부화하며, 다음 날 L1 휴면 상태에서 성장이 정지됩니다.

준비된 이중 가닥 RNA를 발현하는 박테리아로 유충을 옮겨 설정된 시점부터 성장을 재개합니다. 이는 24웰 플레이트에 박테리아를 점적한 날과 동일한 날입니다. 우선 L1 단계의 개체들을 15 mL 튜브로 옮긴 후 원심 분리합니다. 그 다음 개체들을 0.5~1 mL의 M9 용액으로 농축하고, 농축된 선충 5 µL를 플레이트에 접종합니다.

플레이트 위의 개체 수를 세고 농축된 선충 용액을 조정합니다. 3~10 µL당 30마리의 벌레가 되도록 합니다. 마지막으로, 준비된 각 웰의 박테리아 위에 약 30마리의 1단계 개체를 점적합니다.

24웰 플레이트의 웰당 동물 수가 30마리를 초과하면 기아 상태가 될 수 있습니다. 몇 분 후 스팟이 마르면 고무줄로 뚜껑을 고정하십시오. 동물을 뒤집은 상태로 필요한 온도와 시간 동안 배양하여 원하는 단계에서 동물의 점수를 측정하십시오. 선충을 스크리닝할 준비가 되면 양성 및 음성 대조군이 예상되는 표현형을 나타내는지 확인하십시오. 그런 다음 실험 동물의 발달 이상 여부를 관찰하십시오.

다음으로, 해부 현미경을 사용하여 각 웰에서 8~12마리의 동물을 5 µL의 마취제 방울과 함께 4% Agri PET 슬라이드에 고정합니다. 적절한 커버슬립을 덮은 후, 복합 현미경을 사용하여 최소 5마리의 동물을 관찰합니다. 유전자, 관찰된 동물 수 및 표현형 결과를 정리하여 데이터베이스로 기록합니다.

각 RNAi 실험에 대해, 가능하다면 다른 이차 표현형을 통해 생성된 RNAi 표현형을 검증하고 실험을 반복하십시오. 반복 실험 시에는 동일한 스트리킹 플레이트의 박테리아를 사용할 수 있습니다. 오래된 스트리킹 플레이트는 하룻밤 동안의 액체 배양 시 성장이 저조할 수 있으므로, 먼저 다시 스트리킹해야 합니다. 일부 박테리아 배양물은 플라스미드에서 발현되는 유전자 산물로 인해 성장이 원활하지 않을 수 있습니다.

이 경우에는 도말 전 박테리아를 단순히 농축하십시오. 지속적인 스크리닝을 위해서는 스테이징을 위한 배아를 항상 충분히 준비해 두는 것이 중요합니다. 스크리닝 균주는 굶기지 않고 항상 먹이를 공급해야 하며, 관심 있는 표현형에 영향을 줄 수 있는 오염 물질이 없어야 합니다.

동물 먹이 공급을 위한 유지 관리 일정을 수립하였습니다. 이 스크리닝을 위해 설계된 계통을 사용하여 RNAi를 통해 DBL one 국소화에 영향을 미치는 유전자를 식별하였습니다. GFP 태그 dbl one의 정상적인 발현에는 복측 신경삭 세포체와 일련의 점상 구조가 포함되며, DBL에 대한 antisense RNA를 공급받은 동물에서도 확인되었습니다.

하나의 mRNA는 DBL one의 발현을 심하게 감쇄시켰습니다. 이 동물들 또한 기능적인 DBL L one이 결핍된 동물들과 마찬가지로 크기가 작았습니다. RNA I 스크리닝을 통해 DBL one의 국소화에 영향을 주는 다른 많은 유전자들을 성공적으로 식별하였으며, 이를 통해 TGF beta의 세포 내 수송 방식에 대한 이해를 넓히고 향후 더 많은 연구를 위한 출발점을 제공하였습니다.

이 방법을 사용하면 한 사람이 매주 2~4세트의 실험을 무리 없이 준비하고 관찰할 수 있습니다. 예를 들어, 월요일과 화요일에 준비한 동물은 각각 목요일과 금요일에 관찰할 수 있으며, 금요일과 토요일에 다시 동물을 준비하여 다음 주 월요일과 화요일에 관찰할 수 있습니다. 스크리닝 전 과정 동안 이 절차에 따라 관찰을 수행하십시오.

분기별 단계 확인(staging)을 위해 충분한 수의 배아를 준비해 두는 것이 중요하므로, 스크리닝 계통을 정기적으로 유지하십시오. 또한, 모든 관찰 사항에 대해 상세히 기록하는 것이 중요합니다.