단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

다음 실험의 전반적인 목적은 박테리아에 부착 성질을 부여하여 액체 배지로부터의 분리를 용이하게 하는 것입니다. 이는 먼저 복잡한 유전적 조절을 우회하고 끈적이는 폴리머의 쉽고 대량 생산이 가능하도록 합성 curli를 설계함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 폴리스티렌 상에서 부착 박테리아를 시각화하고 정량화하며, 이를 통해 합성 장치의 효율성을 빠르게 추정할 수 있습니다.

다음으로, 공초점 현미경을 통해 유리에 부착된 박테리아를 시각화합니다. 바이오필름을 직접 관찰하고 그 구조에 대한 정보를 얻기 위해, 부착력 및 백분율 측정과 현미경 관찰 모두에서 합성 장치를 보유한 균주의 부착력이 유의미하게 증가했음을 보여주는 결과를 얻습니다. 기존의 일반적인 클로닝과 같은 방법 대비 합성 생물학적 접근 방식의 주요 장점은, 적절한 신호를 포함하여 절대적으로 필요한 유전자만을 보유한 컨스트럭트를 매우 빠르게 얻을 수 있다는 것입니다.

이 방법은 방사성 폐기물에서 금속이 함유된 박테리아를 제거하는 과제와 같이 생물학적 복원 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 유전적 조절 신호 및 데이터베이스 처리에 관한 기초 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 시각적 시연은 바이오필름의 정량화와 시각화에 중점을 둘 것인데, 이는 바이오프레임의 취약성으로 인해 이 두 단계를 학습하기가 매우 어렵기 때문입니다.

합성 카론(carron)을 설계하기 위한 첫 번째 단계는 curly 유전자의 유전적 구성을 결정하고, 이들의 내재적 전사 및 번역 신호를 국소화하는 것입니다. 이는 REON DB 또는 eco gene과 같은 전문 데이터베이스를 사용하여 수행됩니다. 다음 단계는 curly 합성에 절대적으로 필요한 5가지 유전자를 선택하는 것입니다. CSGB와 CSGA는 섬유 단량체를 코딩하며, C-S-G-E-C-S-G-F 및 CSGG는 curling 분비 복합체를 코딩합니다. 선택한 서열을 데이터베이스에서 FASTA 형식으로 추출하여 데이터 관리를 수행하고, C-S-G-G-F-E 클러스터가 E. coli 게놈에서 안티센스(antisense) 방향이므로 clone manager 소프트웨어를 사용하여 in silico 사전 분석을 수행합니다.

이 서열은 상보적 역서열로 변환되어야 합니다. 클론 매니저 도구의 operations process molecule invert molecule 기능을 사용하십시오. ligate 기능을 사용하여 C-S-G-E-F-G 서열을 C-S-G-B-A 뒤에 붙여넣으십시오. 다음으로, C-S-G-B-A-E-F-G iCal 서열 앞에 적절한 프로모터 PRCN을 추가하십시오.

RCN 유전좌위는 니켈 및 코발트 해독을 담당하는 FLX 펌프 RCNA와 그에 상응하는 금속 조절자인 RCNR을 인코딩합니다. 코발트나 니켈이 없을 때, 억제제 RCNR은 DNA의 RCNR 박스에 결합하여 하위 유전자의 완전한 전사 활성화를 방지합니다. 세포 내 코발트나 니켈 농도가 상승하면, 코발트 또는 니켈이 RCNR 단백질에 결합하여 억제제가 프로모터에 고정되는 것을 방지하며, 선택된 5개의 curly 유전자를 프로모터의 제어 하에 둠으로써 P-R-C-N-A의 전사 활성이 증가합니다.

PRCN curly는 코발트와 니켈이 존재할 때 과잉 생산될 것으로 예측됩니다. 이어서 CS gba DNA 서열의 첫 번째 ATG 앞에 완벽한 리보솜 결합 부위(RBS)를 추가하고, C-S-G-E-F-G 서열 앞에 두 번째 완벽한 RBS를 추가하여 전사 신호를 최적화하십시오. iGEM 표준에 맞추기 위해, 해당 장치는 Eco RI 및 Xba I 제한 효소 부위를 포함하는 표준 바이오브릭 접두사와, 추가 조립을 용이하게 하기 위해 Spe I 및 Pst I 제한 효소 부위를 포함하는 접미사로 둘러싸여 있어야 합니다.

바이오 브릭(bio brick) 부품 자체에는 EcoRI, PstI, SpeI 및 XbaI 인식 부위가 포함되어서는 안 됩니다. 따라서, 실리코(in silico) 제한 효소 분석을 통해 장치 내 CSGA 서열에서 PstI 부위 1개, RCNR 서열에서 PstI 부위 1개, 그리고 CSGE 유전자에서 EcoRI 부위 1개가 발견되었으며, 이러한 부위들은 침묵 돌연변이(silent mutation)를 통해 제거되었습니다.

합성 오페론(synthetic operon)의 설계가 완료되면, 클론 매니저 소프트웨어를 사용하여 번역 시뮬레이션을 수행하십시오. 서열 정렬 프로그램인 blast를 사용하여 야생형 curly 단백질과 합성 오페론에 의해 인코딩된 단백질 사이의 완벽한 상동성을 확인하십시오. 2% glucose가 함유된 M 63 최소 배지 2 mL를 사용하여 24웰 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 대해 이 절차를 시작하십시오. 각 웰에 하룻밤 동안 배양한 박테리아 배양액 10⁶ cells를 접종하십시오. 박테리아를 30 °C에서 흔들지 않고 18~48시간 동안 배양하십시오. 24웰 플레이트의 각 열은 하나의 모달리티(modality)를 나타냅니다.

필요에 따라 적절한 양의 코발트와 항생제를 첨가합니다. 처음 세 줄은 3회 반복 실험의 평균값을 통해 부착 박테리아 A의 양을 정량화하는 데 사용됩니다. 마지막 왼쪽 줄은 18~48시간 후 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 바이오필름을 시각화하는 데 사용하며, 24-well 플레이트의 처음 세 줄에 있는 각 웰에서 부유 세포가 포함된 상층액을 회수하여 이를 용혈관으로 옮깁니다.

각 웰을 1 mL의 M 63 배지로 조심스럽게 헹군 후, 초기 상층액과 함께 용혈관으로 세척액을 흡입합니다. 이 모아진 액체를 부유 세포라 하며 S라고 명명합니다. 마이크로플레이트 웰 바닥에는 부착 세포가 덮여 있습니다. 바이오필름을 회수하려면 각 웰에 1 mL의 M 63을 추가합니다.

피펫 팁으로 긁어낸 후, 피펫팅을 통해 섞어 바이오필름 분획을 새로운 용혈 튜브로 옮깁니다. 튜브를 15초 동안 볼텍싱합니다. 용혈 튜브에 바이오필름 분획을 수집합니다.

이 풀은 B로 명명된 표면 부착 세포를 나타냅니다. 용혈관의 상층액과 바이오필름 분획 200 µL를 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 600 nm에서의 광학 밀도를 통해 표면 부착 박테리아와 부유 박테리아의 수를 추정합니다. 각 양식의 부착 백분율은 B × 100 / (3 × S + B) 공식을 사용하여 계산합니다. 24-웰 플레이트의 마지막 행에 대해서만 바이오필름을 시각화하려면 해당 웰에서 플랑크톤 세포를 제거합니다.

플레이트 바닥에 형성된 바이오필름을 세척하기 위해 각 웰에 M 63 1 mL를 추가합니다. 덮개를 열어둔 상태로 플레이트를 80 °C에서 1시간 동안 건조한 후, 각 웰에 20% crystal violet 100 µL를 추가하고 물로 충분히 세척합니다. 이 프로토콜에는 형광 섀시가 필요합니다.

합성 curli를 포함하는 플라스미드에 적합한 숙주는 E. coli SCC1 균주이며, 이 균주는 모균주인 MG 1655와 관찰 가능한 차이 없이 녹색 형광 단백질을 지속적으로 발현합니다. 합성 curli를 포함하는 pUC57 플라스미드를 숙주 균주에 형질전환하여 S23 균주를 얻습니다. 숙주 균주를 대조군 플라스미드 pUC18로 형질전환하여 대조군 균주를 얻습니다.

S 23 및 S 24 균주의 야간 배양 전배양액을 30 °C에서 배양합니다. 다음 날, 포도당과 앰피실린이 첨가된 M 63 배지 20 mL를 페트리 접시에 넣은 후, 100 µL의 전배양액을 사용하여 페트리 접시 내의 M 63 배지 15 mL에 접종합니다. 적절한 농도의 코발트를 첨가하고, 코발트가 없는 음성 대조군을 반드시 포함하십시오.

각 페트리 접시에 직사각형 유리 커버슬립 3개를 넣습니다. 접시를 30 °C에서 흔들지 않고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 형광 현미경을 통해 박테리아를 직접 관찰할 수 있습니다.

시료가 마르는 것을 방지하는 것이 중요하므로, 다음 단계들은 세심하면서도 빠르게 수행해야 합니다. 페트리 접시에서 각 커버슬립을 제거하고 조심스럽게 액체를 따라냅니다. 공초점 관찰을 위해 70% ethanol을 적신 작은 면봉으로 하단면을 조심스럽게 닦아 모든 박테리아 잔해를 제거합니다.

바이오필름이 윗면을 향하도록 커버슬립을 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 그 후 바이오필름 위를 더 큰 커버슬립으로 덮고, 바니시를 이용해 유리 슬라이드에 고정합니다.

바이오필름이 아래쪽 면에 위치하도록 장치를 뒤집습니다. 이번 실험에서는 장치를 공초점 레이저 현미경 아래에 배치합니다. CT 마이크로 플랫폼 내에서 Zeiss LSM 510 Meta 공초점 레이저 현미경이 사용됩니다.

40배 오일 침강 렌즈를 선택하십시오. 488 nm에서 GFP를 여기시키고 500에서 600 nm 범위의 박테리아 형광을 수집하는 다음 설정을 사용하십시오. 이미지 획득을 위해 40배 오일 침강 렌즈를 사용하십시오.

레이저 주사 공초점 모드에서, 고체 표면부터 성장 배지와 맞닿은 계면까지 바이오필름의 전체적인 3차원 구조를 스캔합니다. 이때 스캔 간격은 1 µm로 설정합니다.

마우스 소프트웨어를 사용하여 3차원 투영을 수행하고, 통계적 종단면을 따라 평균 C 값을 분석하여 바이오필름 두께를 결정합니다. 공초점 Z-스택에서 바이오필름의 정량화 및 생물학적 부피를 추출할 수 있습니다. 금속에 반응하여 curli를 과잉 생산하도록 설계된 e coli의 부착 능력은 간단한 방법으로 평가할 수 있습니다.

예를 들어, 24웰 연마 처리된 Irene 플레이트에서 크리스탈 바이올렛 염색을 실시하면 각 웰 바닥의 바이오필름 형성 여부를 보라색 색강도의 차이를 통해 빠르게 시각화할 수 있습니다. 야생형 균주가 엔지니어링된 균주보다 부착력이 낮은 것으로 보입니다. 정량적 방법으로는 다양한 농도의 코발트 조건에서 야생형 및 엔지니어링된 균주의 폴리스티렌 부착률을 측정하는 것이 있습니다.

이 그래프에 제시된 결과는 코발트가 없을 때 조작된 균주의 부착률이 야생형 균주보다 1.5배 더 높다는 것을 보여줍니다. 또한, 코발트 농도가 증가함에 따라 부착력이 유의미하게 강화되는 것이 관찰되었으며, 25 µM 또는 50 µM의 코발트 농도를 포함하는 배지에서 조작된 세포의 부착률은 각각 30%와 40%에 도달했습니다. 부착 능력은 유리 슬라이드에서 배양한 GFP 태그 박테리아를 이용한 현미경 관찰을 통해 비교할 수도 있는데, 검은색 배경에서 녹색 박테리아를 관찰한 에피 형광 현미경 결과, 조작된 균주는 바이오필름을 형성하는 반면, 야생형 균주는 화살표로 표시된 것과 같이 미세 군락만을 형성함을 알 수 있습니다.

공초점 현미경 분석을 통해 바이오필름 3차원 구조의 전반적인 모습을 확인할 수 있습니다. 상단 뷰 재구성 이미지는 패널 A에, 측면 뷰 재구성 이미지는 패널 B에 나타나 있습니다. 결과는 엔지니어링된 균주가 야생형보다 더 잘 부착되며, 더 조밀하고 두꺼운 바이오필름을 형성한다는 것을 확인시켜 줍니다. 이 절차를 수행할 때는 방사성 폐수 환경에서 변형된 e coli 또는 occus ants의 생물학적 매개 가능성을 탐색하는 것과 같이 실험 설계 내용을 다시 한번 세밀하게 점검하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후에는 클론 매니저 소프트웨어를 사용하여 합성 오페론을 설계하는 방법과 박테리아 균주의 발현량을 빠르게 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 합성 유전자 및 유전자 변형 생물을 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안에는 변형된 박테리아의 오토클레이브 멸균과 같은 예방 조치와 현행 법규에 따라 적절한 관리가 이루어져야 합니다.