단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

본 비디오 논문은 화학적으로 블로킹된 항체 마이크로어레이를 사용하여 간세포암 환자의 혈청 샘플 내 20가지 서로 다른 당단백질의 당화 프로파일을 얻는 절차를 설명합니다. 먼저 당단백질 특이적 항체를 마이크로어레이 슬라이드에 직접 프린팅하고, 렉틴 결합을 방지하기 위해 항체의 당쇄를 블로킹합니다. 환자의 혈청 샘플을 도포하면, 샘플 내의 당단백질이 항체에 의해 포획됩니다. 그 후 비오틴화된 당쇄 결합 단백질을 첨가하여 당쇄를 검출하고, 비오틴화된 렉틴을 표지하기 위해 디-접합된 뉴트라바인(neu travain)을 첨가합니다.

이후 마이크로어레이 슬라이드를 스캔하여 형광을 검출하며, 결과 데이터의 분석을 통해 시료 단백질의 당화 프로파일을 확인합니다. 이 기술은 HPLC와 같은 기존 방법보다 여러 가지 장점이 있습니다. 특히, 이 방법은 개별 당단백질을 천연 상태 그대로 검출할 수 있게 해줍니다.

여러 단백질의 당화 변형을 동시에 스크리닝하는 것이 더 빠르고 쉽습니다. 연구 결과, 질병의 바이오마커, 특히 우리가 가장 면밀히 살펴본 암과 간암의 바이오마커들이 흔히 당화되어 있음을 확인했습니다. 또한 특정 당형(glycoform)을 검출하는 능력이 바이오마커의 민감도와 특이도 측면에서 성능을 크게 향상시킨다는 것을 발견했습니다.

따라서 이 측정법은 HCC의 여러 혈청 단백질에서 나타나는 당화 변화에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 췌장암, 당뇨병, 알츠하이머병과 같은 다른 암 및 질환의 병리학적 연구와 바이오마커 발굴에도 적용될 수 있습니다. 본 실험 절차의 시연은 저희 연구실의 기술원인 Chen Lu가 진행하겠습니다.

본 프로토콜은 항체 마이크로어레이 준비부터 시작합니다. 먼저 얼음 위에서 0.8 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 마이크로어레이 프린팅에 사용될 모든 항체를 40 milliliters 이상의 PBS를 사용하여 0.5 milligrams per milliliter 농도로 희석합니다. 여기서는 26가지의 서로 다른 항체가 양성 대조군으로 사용됩니다. 또한 PBS에 희석된 0.5 milligrams per milliliter 농도의 biotinylated BSA를 동일한 양으로 준비합니다. 피펫을 사용하여 각 항체 40 milliliters를 얼음 위에 놓인 384 well 소스 플레이트에 분주합니다.

그 다음 마이크로어레이 제어 소프트웨어에서 각 항체의 위치를 지정합니다. 이어서, 플레이트를 소스로 하여 마이크로어레이에 로드합니다. 그런 다음 20개의 병리 마이크로어레이 슬라이드를 타겟으로 하여 마이크로어레이에 로드합니다.

마이크로어레이 설정을 통해 27종의 항체와 대조 단백질이 9x9 패턴으로 3회 반복 점적된 48개의 동일한 서브어레이가 인쇄되도록 합니다. 항체 마이크로어레이 슬라이드 인쇄를 시작하십시오. 인쇄된 항체 마이크로어레이 슬라이드를 수거하여 제습제가 들어 있는 슬라이드 카세트에 보관하십시오.

단백질 변성과 슬라이드의 습기 발생을 방지하기 위해 카세트를 플라스틱 백으로 밀봉하십시오. 밀봉된 마이크로어레이 슬라이드는 사용 전까지 4°C에서 보관하십시오. 이 절차에서 가장 어렵고 중요한 단계는 화학적 블로킹 단계입니다.

성공적인 결과를 얻기 위해서는 마이크로어레이 슬라이드에 충분한 양의 항체가 프린팅되는 것이 매우 중요합니다. 실험 직전에 항상 신선한 sodium IDE와 agro acid hydrocyte를 준비하십시오. 또한, 빛을 차단한 상태에서 4°C로 산화 과정을 수행하시기 바랍니다.

마이크로어레이 슬라이드를 냉장고에서 꺼내 30분 동안 상온에서 평형 상태가 되도록 둡니다. 보관함에서 슬라이드를 하나 꺼냅니다. 0.1% tween 20이 포함된 PBS가 담긴 세척 베이슨에 슬라이드를 잠시 담급니다.

그 다음, 0.1% tween이 포함된 15 millimolar sodium acetate 버퍼에 슬라이드를 10분 동안 담급니다. 이어서, 15 millimolar sodium acetate 버퍼로 신선한 150 millimolar sodium periodate를 준비하여 슬라이드 세척조로 옮깁니다. 사용 전까지 빛을 피해 냉장 보관하십시오. sodium acetate 버퍼에서 슬라이드를 꺼내어, 항체가 부착된 면이 위로 향하게 하여 신선한 sodium periodate가 담긴 세척조에 넣습니다.

빛을 차단하기 위해 베이슨을 알루미늄 호일로 덮습니다. 그런 다음 슬라이드 베이슨을 4 °C에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 베이슨에서 슬라이드를 꺼내어 sodium acetate buffer로 5분 동안 세 번 짧게 헹굽니다.

슬라이드를 갓 조제한 10 millimolar hydro glutamic acid 블로킹 용액 300 milliliters가 담긴 배양 챔버에 넣고, 실온에서 완만하게 흔들어주며 2시간 동안 배양합니다. 챔버에서 슬라이드를 꺼내 0.1%tween이 포함된 PBS로 3분 동안 세척합니다. 다음으로, 슬라이드 세척조에서 마이크로어레이 슬라이드를 0.5%tween이 포함된 PBS 내 1%BSA 300 milliliters에 넣고 실온에서 완만하게 흔들어주며 1시간 동안 배양합니다.

0.1% tween이 포함된 PBS로 슬라이드를 3분씩 세 번 헹굽니다. 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓고 1,200 ×g에서 2분간 회전시켜 마이크로어레이 슬라이드를 건조합니다. 각 서브어레이를 구분하기 위해 슬라이드에 왁스 그리드가 각인되어 있습니다.

왁스 임프린터를 70 °C에서 5분 동안 예열한 후, 항체 면이 왁스를 향하도록 블로킹된 마이크로어레이 슬라이드를 왁스 임프린터에 장착합니다. 핸들을 부드럽게 당겨 슬라이드에 왁스를 균일하게 임프린팅합니다. 이 방법은 단일 샘플의 당쇄 프로파일링 분석이나 다수 샘플의 단일 당쇄 에피토프 측정에 모두 사용할 수 있습니다.

여기서는 당쇄 프로파일링 분석법을 시연하겠습니다. 먼저 40 µL의 혈청을 0.1% tween 0.1% bridge 35 및 각각 100 µg/mL의 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 당나귀 IgG가 포함된 360 µL의 PBS에 희석하십시오. 이 부피는 각 서브 어레이에 희석된 혈청 용액 6 µL를 도포하기에 충분한 양입니다.

희석된 시료 또는 대조군 6 µL를 슬라이드의 각 서브 어레이에 조심스럽게 도포합니다. 젖은 페이퍼 타월이 들어 있는 가습 카세트 내에서 슬라이드를 실온으로 1시간 동안 배양합니다. 0.1% tween이 포함된 PBS로 슬라이드를 3분 동안 세 번 헹굽니다.

그 후 슬라이드를 1200 ×g에서 2분 동안 원심 분리하여 건조시킵니다. 0.8 mL 마이크로 튜브에 10 mg/mL 농도의 비오틴화 글리칸 결합 단백질 20 µL를 PBS tween으로 준비하여 얼음 위에 둡니다. 희석된 비오틴화 렉틴 6 µL를 슬라이드의 각 서브 어레이에 도포하고, 젖은 페이퍼 타월을 넣은 가습 슬라이드 박스에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다.

이전과 동일하게 0.1% tween이 포함된 PBS로 슬라이드를 세 번 헹군 후, 원심분리기에서 1200 ×g로 2분간 회전시켜 슬라이드를 건조합니다. 얼음 위에서 0.8 mL 마이크로 튜브에 10 mg/mL DITE 5 49 labeled neutravidin이 포함된 PBS 0.1% tween 400 µL를 준비합니다. 리피트 피펫을 사용하여 각 서브 어레이에 6 µL의 DITE 5 49 labeled neutravidin을 도포하고, 가습된 슬라이드 카세트 내에서 상온으로 1시간 동안 배양합니다.

슬라이드를 0.1% tween이 포함된 PBS로 3분씩 세 번 헹굽니다. 원심분리기에서 1200 ×g로 2분간 회전시켜 슬라이드를 건조합니다. 형광 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 10 millimeter 해상도로 슬라이드를 스캔합니다.

레이저 및 PMT 설정은 포화 상태가 관찰되지 않는 범위 내에서 최대한 강하게 설정해야 합니다. Array Pro 3.2에서 이미지를 엽니다. 항체 스팟 위치가 표시된 어레이 맵에 따라 어레이 템플릿을 설정하십시오.

각 템플릿 원을 이미지의 해당 스팟에 정교하게 맞춘 후, 추가 분석을 위해 각 스팟의 강도를 Excel 파일로 추출합니다. 20종의 혈청 당단백질과 biotin에 대한 26종의 항체를 포함하는 48개의 동일한 서브 어레이로 구성된 항체 마이크로어레이 BSA가 이 비디오에 설명된 대로 설계 및 제작되어 블로킹 절차의 중요성을 조사하였습니다.

당단백질 프로파일링 분석을 위해 두 개의 동일한 마이크로어레이 슬라이드를 제작하였습니다. 하나는 화학적 블로킹을 처리하지 않았으며, 다른 하나는 블로킹을 처리하였습니다. 대조군 샘플은 1열과 3열의 서브어레이에 도포하였고, 혼합 HCC 혈청 샘플은 2열과 4열의 서브어레이에 도포하였습니다.

그 후, 서로 다른 글리칸에 특이적인 비오틴화 렉틴을 서브 어레이에 적용하였으며, 이는 서브 어레이 이미지에 나타나 있습니다. 블로킹되지 않은 마이크로어레이에서는 렉틴이 대조군 컬럼의 캡처 항체에 결합하여, 혈청이 로딩된 컬럼과 구분이 불가능할 정도의 높은 배경 신호가 나타났습니다. 하지만 화학적으로 블로킹된 항체 마이크로어레이 슬라이드에서 동일한 실험을 수행했을 때, 대조군 컬럼의 캡처 항체에는 결합이 없거나 매우 낮게 나타난 반면, 혈청이 로딩된 컬럼에서는 높은 항원 결합이 관찰되었습니다.

이러한 결과는 화학적 블로킹 과정이 항체로 캡처된 당단백질의 글리칸 측정에 있어 매우 중요한 단계임을 입증합니다. 이 프로토콜을 따르면 간세포암(HCC) 혈청 내 22종 당단백질의 당화 프로파일을 얻을 수 있습니다. 숙달되면 이 기술은 적절하게 수행했을 때 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 항체는 변형될 경우 항원에 대한 친화력 및 기타 특성을 잃을 수 있습니다.

따라서 이를 염두에 두고, 본 절차를 따를 때는 서로 다른 공급처의 여러 가지 항체를 사용하는 것이 중요합니다. 당쇄화의 변화가 단백질 발현 수준의 변화로 인한 것인지, 아니면 개별 단백질의 당쇄화 변화만으로 인한 것인지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 동일한 마이크로어레이 슬라이드를 사용하여 각 단백질 농도를 검출하는 등의 추가 조치를 수행할 수 있습니다. 병원균이 포함된 혈청 샘플을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.