전자 코를 사용하여 과일 휘발성 분석

이 실험 절차의 전반적인 목표는 과일 내 휘발성 화합물을 신속하게 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 과일 조직을 절단하고 균질화합니다. 그 후 액체 시료 상단의 기상(vapor phase)을 전자코로 분석합니다.

전자 코 분석 후, 데이터를 내보내고 변환합니다. 절차의 마지막 단계는 그래픽 인터페이스를 사용하여 covas 지수 윈도우를 식별하고 피크들을 하나의 covas 지수 레이블로 통합하는 것입니다. 최종적으로, 전자 코로 측정한 과일 난포의 풍부도 차이가 과일 품종, 성숙도 및 저장과 같은 실험적 처리와 관련이 있음을 보여줍니다.

전통적인 가스 크로마토그래피와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 과일 내 휘발성 화합물을 더 신속하게 분석할 수 있다는 점입니다. 이 분석을 수행할 때 분석물의 머무름 시간(retention time)에 약간의 변화가 발생할 수 있습니다. 피크 정렬 과정을 세심하게 고려하지 않으면 데이터 해석에 오류가 생길 수 있습니다.

원하는 성숙 단계에서 과일을 수확한 후 수돗물로 헹굽니다. 이물질과 먼지를 제거한 뒤 분석에 사용할 과일을 선택합니다. 외관 및 내부 결함이 없고 크기가 균일한 것을 기준으로, 휘발성 성분 시료 채취에 사용할 수 있도록 과일을 세로 방향으로 쐐기 모양으로 절단합니다.

해당하는 경우, 껍질 씨앗, 종자강 조직 또는 과핵을 제거하십시오. 실험 전반에 걸쳐 조직 선택이 일관되어야 하며, 단일 과일 내의 변동성을 고려해야 합니다. 예를 들어, 샘플은 적도 방향의 꽃 끝 부분과 줄기 끝 부분에서 동일하게 얻어야 합니다.

선택한 과일 조직을 모아 무작위로 섞은 다음, 200g을 측정하여 상용 블렌더에 넣습니다. 포화 염화칼슘 용액 200mL를 추가합니다. 염화칼슘은 과육을 절단하고 균질화하는 과정에서 발생할 수 있는 효소 활성을 억제하기 위해 사용됩니다.

그 다음, 메탄올에 용해된 100 millimolar 농도의 two methyl butyl iso ate 용액 50 µL를 첨가합니다. 이 용액은 균질화 과정 중 휘발성 화합물의 잠재적 손실을 모니터링하기 위한 내부 표준물질로 첨가됩니다. 이어서, 실험실 블렌더를 사용하여 혼합물을 18,000 RPM에서 30초 동안 균질화합니다.

그 다음 즉시 유리 병에 붓고 테플론 뚜껑으로 밀봉하십시오. 모든 시료가 준비될 때까지 균질액을 병에 보관하십시오. 거품이 없는 즙 5 mL를 20 mL 갈색 유리 바이알에 분주하며, 시료당 최소 3개의 바이알을 준비하십시오.

기술적 반복 실험군으로 사용합니다. 테플론 실리콘 격막이 장착된 스틸 스크류 캡으로 바이알을 밀봉합니다. 이 시점에서 샘플을 즉시 분석하거나, 액체 질소로 급속 냉동하여 초저온에 보관한 후 나중에 분석할 수 있습니다.

Xenos에 적절한 분석 방법을 로드하십시오. 서면 프로토콜에 기재된 대로 파라미터를 입력하십시오. 비천공 팁이 달린 스테인리스 스틸 바늘을 Xenos 입구에 연결하십시오.

기저선이 안정되고 200 counts 이상의 피크가 검출되지 않을 때까지 주변 공기로 시스템을 여러 번 퍼지합니다. 압력을 낮추기 위해 직선 사슬 acas 용액이 담긴 바이알의 격막에 니들을 삽입하여 기기 튜닝을 준비합니다. 그 다음, 기기 입구에 연결된 니들을 격막에 삽입합니다.

헤드스페이스 샘플링을 시작하여 튜닝을 수행합니다. 튜닝 결과는 기기 소프트웨어에서 해당 피크의 머무름 시간을 시간 단위에서 covas index 또는 KI 단위로 변환하는 데 사용됩니다. 따라서 시스템 튜닝 후에는 머무름 시간이 KI 단위로 보고됩니다.

샘플 바이알의 셉텀에 바늘을 삽입하여 샘플을 30분 동안 평형 상태로 둔 후 샘플 분석을 시작하십시오. 직쇄형 acas 용액에 적용했던 것과 동일하게 수행합니다. 재생 버튼을 클릭하여 헤드스페이스 샘플링을 수동으로 시작하면, 펌프가 작동하여 샘플 상단에 존재하는 증기를 흡입합니다.

분석이 종료되면 화면에 크로마토그램이 나타나며, 센서를 세척하기 위해 센서가 자동으로 150 °C에서 10초 동안 가열됩니다. 시스템 상태 상자가 다시 녹색으로 변하면 기기가 다른 시료를 분석할 준비가 된 것입니다. 안정적인 베이스라인과 적절한 시스템 세척을 보장하기 위해, 각 시료 분석 사이에 최소 한 번의 공기 공시료(air blank) 분석을 수행하십시오.

샘플당 최소 3회 이상의 기술적 반복 실험과 함께 vial blank를 분석하십시오. Mense 소프트웨어의 log stored data 기능을 사용하여 획득 후 데이터를 Microsoft Excel 파일로 내보내십시오. 데이터가 내보내지면 변수와 반복 횟수에 대한 라벨이 포함된 열을 추가하십시오.

기기 소프트웨어에서 내보낸 데이터 형식은 본 실험실에서 생성한 Python 0.6 스크립트를 사용하여 더 쉽게 조작할 수 있는 형태로 변환할 수 있습니다. 입력 데이터의 소스 파일 이름과 시트 이름, 그리고 출력 파일로 지정할 이름은 스크립트 내에서 직접 수정합니다. 이 스크립트는 모든 샘플에 걸쳐 고유한 kis를 식별함으로써 데이터 조작 및 분석을 용이하게 합니다.

데이터는 행에 샘플 정보가, 열에 고유한 KIS가 배치되도록 재정렬되며, 각 셀은 해당 피크 면적을 나타냅니다. 샘플 내 특정 KI 값에 대해 피크가 검출되지 않은 경우, 해당 셀은 빈칸으로 남겨둡니다. 다음으로, 이 랩 임포트(lab import)를 통해 생성된 두 번째 스크립트를 사용하여 이전 단계에서 편집한 파일의 데이터를 처리합니다.

분석은 각 KI 값이 검출된 횟수를 확인하고 분석하는 것을 기반으로 합니다. 따라서 프로그램은 KI 히트(hit) 횟수를 막대 그래프로 표시합니다. 각 KI 값에 대해 특정 샘플 서브셋의 K 히트 횟수를 평가하며, 이때 각 기술적 반복군(technical replicates) 그룹을 함께 분석합니다.

이를 위해 해당 확인란을 선택하거나 해제하여 모든 처리구 또는 변수를 개별적으로 분석하십시오. 그래픽 인터페이스를 사용하여 각 KI 윈도우의 너비를 확인한 후, 해당 크로마토그램 중 일부를 무작위로 선택하십시오. mense 소프트웨어를 사용하여 기술적 반복 시료 간의 중첩 피크를 평가하십시오.

KI 윈도우가 개별화되면, 그래픽 인터페이스의 병합(merge) 기능을 사용하여 윈도우 내에 포함된 KIS를 가장 개체 수가 많은 ki로 병합합니다. 먼저 병합 버튼을 클릭하여 기능을 활성화하고, 해당 막대를 왼쪽 클릭하여 윈도우 중심에 있는 가장 개체 수가 많은 ki를 선택하십시오. 막대가 선택되면 색상이 녹색으로 변경됩니다. 윈도우 내에 포함된 KIS를 선택한 ki로 병합하려면 해당 막대들을 오른쪽 클릭하십시오.

이 과정을 통해 막대가 빨간색으로 변하며, 해당 길이의 파란색 막대가 중앙 ki 위에 추가됩니다. 선택한 모든 ki가 적절한 중앙 ki로 병합되면, 변경 사항을 적용하기 위해 병합 버튼을 다시 클릭하십시오. 실수로 잘못 조작했을 경우를 대비하여 병합 버튼은 노란색으로 변합니다.

병합을 해제하려면 병합 해제 버튼을 사용할 수 있습니다. 그래픽 인터페이스에서 병합 해제 버튼을 클릭하십시오. 그런 다음 병합을 해제할 빨간색 막대를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오.

막대의 색상이 빨간색에서 파란색으로 변합니다. 변경 사항을 적용하려면 병합 해제 버튼을 다시 클릭하십시오. 단일 샘플의 두 피크를 하나의 KI 값으로 잘못 병합하려고 시도하면 오류 메시지가 출력됩니다.

모든 병합 작업이 저장되어 통계 분석을 진행하기 전, 공기 및 바이알 블랭크의 크로마토그램을 분석하여 잠재적인 오염 여부를 모니터링합니다. 피크와 블랭크의 ki가 확인되면, 공기 또는 바이알 블랭크에서 검출된 피크의 면적을 시료에 존재하는 피크의 면적에서 뺍니다. 전자코는 서로 다른 숙성 단계에서 수확한 멜론 과실 간의 휘발성 프로필 차이를 검출할 수 있었습니다.

여기 초기 성숙 과실과 완전 성숙 과실의 크로마토그램 예시가 제시되어 있으며, 피크 면적의 차이를 보여줍니다. 수많은 피크에 대해 모든 샘플에서 20 K 윈도우가 식별되었습니다. 변이 분석 결과, 이러한 서로 다른 kis 중 전자코에 의해 검출된 14개 피크의 풍부도가 두 성숙 단계 사이에서 유의미하게 다르게 나타났습니다. 여기에서 각 kis에 대해 초기 성숙 과실의 피크 풍부도는 녹색으로, 완전 성숙 과실의 피크 풍부도는 주황색으로 표시되었습니다.

본 절차를 완료한 후, 전자코 개발이 이루어지면 가스 크로마토그래피 질량 분석법(GC-MS)과 같은 다른 방법을 통해 개별 피크에 해당하는 성분을 식별할 수 있습니다. 이 기술은 신속한 분석 도구를 제공하여 식물 병리학, 식물 생리학, 수확 후 생물학 및 식품 과학 분야의 연구자들이 숙도, 품종 또는 저장 조건에 따른 과일의 휘발성 성분 변화를 탐구할 수 있게 해줍니다. 이 영상을 시청하고 나면 전자코를 이용해 휘발성 화합물을 신속하게 분석하는 방법과 그래픽 인터페이스를 사용하여 피크 정렬을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.