멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

다음 실험의 전반적인 목표는 TNF Alpha 사이토카인에 대해 이미 최적화된 Eliza 분석법을 Xap 플랫폼으로 전환하면서 대안적인 항체 쌍을 평가하는 것입니다. 이는 ELIZA 키트의 포획 항체와 세 가지의 다른 후보 포획 항체를 서로 다른 네 가지의 마이크로스피어 또는 비드 세트에 혼합하여 결합함으로써 달성됩니다. 이 네 가지 세트를 통해 네 가지 후보 항체 모두를 네 가지의 서로 다른 검출 항체와 동시에 테스트하여 최적의 항체 쌍을 결정할 수 있습니다.

이후 가장 최적화된 두 가지 항체 쌍을 사용하여 두 가지 Xap 분석법을 구축합니다. 그런 다음 신호 강도, 동적 범위 및 민감도 측면에서 이 분석법들의 성능을 기존 EISA 분석법과 비교합니다. 결과에 따르면, 유사한 항체라도 동일한 조건에서 매우 다르게 작용할 수 있으며, Luminex Xap 분석법을 통해 여러 항체를 동시에 스크리닝할 수 있음을 알 수 있었습니다. 또한, 이 분석법이 EISA와 비교했을 때 민감도와 동적 범위가 향상되었음을 확인하였습니다.

EIS A와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 xap 기반 면역 분석법을 통해 연구자가 여러 표적을 테스트하거나, 본 사례와 같이 여러 항체를 동시에 테스트할 수 있다는 점입니다. 가장 우수한 항체를 확인하기 위한 절차는 Luminex Corporation의 부연구원인 Erica Lopez가 시연할 예정입니다.

서면 프로토콜에 설명된 대로 인간 TNF alpha에 특이적인 4종의 캡처 항체와 4종의 검출 항체를 선택하고 준비하여 본 프로토콜을 시작하십시오. 또한, 캡처 항체의 숙주 종에 특이적인 확인 항체 1종을 준비하십시오. 항체 결합 키트에 포함된 시약들을 상온으로 맞추십시오.

결합 반응에 선택된 비드 영역 번호로 반응 튜브 4개에 라벨을 붙입니다. mag plex 마이크로스피어 바이알 4개의 내용물을 라벨이 붙은 반응 튜브 4개로 옮깁니다. 각 비드 세트를 500 µL의 활성화 버퍼로 2회 세척하고, 항체 결합 키트에 설명된 대로 sulf ONHS 및 EDC 용액으로 각 비드 세트를 활성화합니다.

사용자 매뉴얼: 로테이터에서 20분간 배양한 후, 활성화된 비드를 사용하여 이전의 세척 단계를 활성화 버퍼 500 µL로 총 3회 반복하십시오. 각 세척 시, 캡처 항체 7.5 µg이 포함된 500 µL 용액 4개를 각각 준비하십시오. 비활성화 버퍼를 사용합니다.

이 네 가지 포획 항체 용액을 각각의 반응 튜브에 넣습니다. 각 튜브를 즉시 볼텍싱하고 로테이터에서 2시간 동안 배양합니다. 항체 결합 키트에 포함된 세척 완충액 500 µL를 사용하여, 항체가 결합된 비즈의 세척 단계를 총 3회 반복합니다.

마지막 세척 단계 후, 각 반응 튜브에 세척 버퍼 500 µL를 첨가하여 최종 스톡 농도가 mL당 500만 개의 항체 결합 비드가 되도록 하고, 볼텍싱한 다음 반응 튜브를 초음파 처리하여 비드를 분산시킵니다. 세포 계수기 또는 혈구 계수기(hemo cytometer)를 사용하여 결합 반응 후 회수된 비드의 수를 측정합니다. 결합 반응의 회수율은 일반적으로 90% 이상입니다. 어세이 버퍼 내 최종 농도가 µL당 100개의 비드가 되도록 각 세트의 결합 비드 스톡 테스트 용액을 준비하고, FICO erything labeled antis species의 희석액을 준비하여 결합 반응이 성공적으로 이루어졌는지 확인합니다.

어세이 버퍼에 4 µg/mL 농도로 희석한 IgG 확인 항체를 준비하고, 라운드 바텀 96-웰 플레이트의 웰 4개씩 총 16개의 웰에 각 테스트 용액 50 µL를 분주합니다. 그다음, 배경값을 측정하기 위해 8개의 웰에는 어세이 버퍼 50 µL를 넣고, 나머지 8개의 웰에는 희석한 확인 항체 50 µL를 첨가합니다. 멀티 채널 피펫으로 여러 번 피펫팅하여 반응물을 부드럽게 혼합합니다.

플레이트를 덮고 플레이트 셰이커를 사용하여 상온에서 30분 동안 배양합니다. 플레이트를 자성 플레이트 분리기에 1~2분 동안 놓아 비드를 용액에서 분리합니다. 그런 다음, 분리기에 놓인 상태에서 플레이트를 폐기물 수거함 위로 강하게 뒤집어 액체를 제거합니다.

각 웰에 100 µL의 assay buffer를 가하고 SANE를 플레이트에서 동일한 방식으로 제거하여 두 번 세척합니다. 자성 플레이트 분리기를 사용하여 멀티채널 피펫으로 5회 부드럽게 파이펫팅하여 비드를 100 µL의 assay buffer에 재현탁합니다. Magix 기기와 같은 Luminex xap 장비로 분석합니다.

이 반응의 형광 신호 강도는 비드 표면에 결합된 단백질 양에 정비례하므로, 비드에 결합된 단백질의 상대적인 양을 신속하게 평가할 수 있습니다. xap 분석에서 가장 효과적인 항체 쌍을 결정하기 위해, 각 비드 세트 10 µL를 분석 버퍼 0.96 mL에 첨가하여 네 가지 비드 세트의 초기 혼합물을 준비합니다. 각 항체를 분석 버퍼로 1 µg/mL가 되도록 희석하여 검출 항체 용액을 준비합니다.

마찬가지로 분석 버퍼입니다. R&D Systems TNF alpha 단백질 표준물을 2000 pg/mL로 준비하고, Streptavidin R FICO eryn을 8 µg/mL로 희석합니다. 스크리닝 분석을 위해 CoStar 라운드 바텀 96-웰 플레이트의 16개 웰에 항체가 결합된 비드 혼합물을 각각 50 µL씩 첨가합니다.

그런 다음, 배경값을 측정하기 위해 16개의 웰 중 8개 웰에 50 µL의 분석 버퍼를 첨가합니다. 다음으로, 반응을 측정하기 위해 나머지 8개 웰에 50 µL의 TNF alpha 표준물을 피펫팅합니다. 분석 플레이트 쉐이커로 흔들어주며 빛이 차단된 상온에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 4개의 웰에 4가지 검출 항체를 각각 50 µL씩 추가하며, 이때 2개는 배경 웰로, 나머지 2개는 반응 웰로 사용합니다. 모든 웰에 SAPE 시약을 50 µL씩 추가한 후 동일한 조건에서 30분 동안 배양합니다. 동일한 조건에서 다시 15분 동안 배양합니다.

플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1분 동안 둡니다. 그런 다음 분리기에 놓인 상태에서 플레이트를 폐기물 수거함 위로 강하게 뒤집어 액체를 제거합니다. 16개 웰 각각에 assay buffer 100 µL를 피펫팅합니다.

그 후 자석 분리를 통해 비드에서 액체를 제거합니다. 다음으로, 16개 각 웰에 assay buffer 100 µL를 추가합니다. 사용자 매뉴얼의 적절한 조작법을 참조하여 Luminex mag picks 기기로 플레이트를 읽습니다.

원하는 신호 강도를 충족하는 항체 쌍을 선택하십시오. 최적의 포획 항체를 선택한 후, 해당 항체가 결합된 비드 스톡 100 µL를 분석 버퍼를 사용하여 10 mL로 희석하십시오. 희석된 비드 50 µL를 두 개의 CoStar 라운드 바텀 96웰 플레이트의 78개 웰에 각각 첨가하십시오.

각 플레이트는 서로 다른 검출 항체의 성능을 평가하는 데 사용됩니다. 다음으로, 8,000 pg/mL에서 시작하여 4 pg/mL에서 끝나는 12점 표준 곡선을 준비합니다. R&D Systems 제품을 사용하여 수행합니다.

TNF Alpha 표준 용액의 각 희석액을 50 µL씩 6회 반복하여 각 플레이트에 분주하고, 배경값을 측정하기 위해 assay buffer 50 µL를 6개 웰에 분주하여 플레이트당 총 78개 웰을 준비합니다. 플레이트를 assay plate shaker로 흔들어주며 빛이 차단된 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 첫 번째 플레이트의 78개 모든 웰에 첫 번째 검출 항체 50 µL를 첨가합니다.

두 번째 플레이트에서 두 번째 검출 항체에 대해 동일한 과정을 반복합니다. 동일한 조건에서 플레이트를 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 각 플레이트의 모든 웰에 SAPE 시약 50 µL를 첨가합니다.

두 플레이트를 차광 상태에서 15분 동안 흔든 후, 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1분 동안 둡니다. 분리기에 놓인 상태에서 플레이트를 폐기물 용기 위로 강하게 뒤집어 액체를 제거합니다. 그 다음, 마그네틱 비드에서 액체를 제거하기 전에 플레이트의 78개 웰 각각에 100 µL의 분석 버퍼를 피펫팅합니다.

플레이트의 78개 웰에 각각 100 µL의 분석 버퍼를 비드에 추가한 후, 적절한 작동을 위해 사용자 매뉴얼을 참조하여 MagPicks 장비로 플레이트를 분석하십시오. R&D Systems의 human TNF Alpha TNF SF1 a DUO set ELISA 키트에 포함된 지침을 따르십시오. R&D 키트와 함께 제공된 표준 물질에 의해 생성된 반응을 측정하십시오.

r and d systems의 포획 및 검출 항체를 다른 벤더의 항체로 대체하여 ELISA 분석을 세 번 더 반복합니다. 단순화를 위해 항체를 벤더별로 짝지어 구성하고, EISA 형식의 요구사항에 따라 세 가지 TNF Alpha 단백질 표준물질 각각을 사용하여 각 쌍을 독립적으로 평가합니다. Luminex Xap 분석은 multiplex 방식으로 수행하여, Mag PLX 미세구체에 결합된 TNF alpha 항체 4가지 세트를 조합함으로써 4가지 포획 항체 모두를 혼합물 형태로 평가하였습니다. 포획 항체들은 4가지 비오틴화 검출 항체 각각과 개별적으로 평가되었으며, 이를 통해 하나의 검출 항체가 4가지 포획 항체 각각과 상호작용하는지를 동시에 결정할 수 있었습니다.

분석 결과, R&D Systems DUO 세트의 항체 쌍이 6,183 median fluorescence intensity 또는 MFI 단위의 응답을 나타내어 가장 우수한 성능을 보였습니다. 또한 Millipore와 ABAM의 검출 항체를 RD Systems 포획 항체와 조합했을 때 XAP 분석에서 적절한 응답을 보인 반면, Millipore, ACAM 및 Novus의 포획 항체는 XAP 분석에서 덜 바람직한 응답을 생성하는 것이 관찰되었습니다. 네 가지 항체 쌍을 EISA 형식으로 비교하기 위해 R&D Systems DUO 세트 프로토콜이 사용되었습니다.

오늘날 널리 사용되는 전형적인 EIA 프로토콜을 반영하며 XAP 기술에 사용되는 프로토콜과 유사하기 때문에, 모든 항체 쌍에 R&D Systems 프로토콜을 사용하였습니다. EISA 테스트 결과, R&D Systems의 항체 쌍이 다시 한번 가장 좋은 결과를 나타냈습니다. 항체 반응성의 변동성을 평가하기 위해 사용한 Acama의 항체 쌍은 반응이 나타나지 않았으며, Millipore와 Novas의 항체 쌍은 보통 수준의 반응을 보였습니다.

표준물질의 경우, 세 곳의 서로 다른 공급업체로부터 제공받은 세 가지의 서로 다른 재조합 TNF alpha 단백질 표준물질을 사용하여 네 쌍의 항체를 모두 테스트하였습니다. 데이터 분석 결과, 세 공급업체의 재조합 TNF alpha 단백질 표준물질이 동등한 결과를 나타냈습니다. R&D Systems의 TNF alpha 단백질은 ELSA 및 XAP 분석의 표준 곡선을 작성하는 데 사용되었습니다.

ELI A 분석은 R&D Systems 항체 쌍을 사용하여 수행한 반면, Xap 분석에서는 R&D Systems의 포획 항체와 R&D Systems 또는 Millipore의 검출 항체를 사용하였습니다. R&D Systems의 TNF alpha 단백질을 희석하여 8,000에서 4 pg/mL까지의 농도 범위를 생성하였습니다. R&D Systems의 항체 쌍은 Xap 분석에서 표시된 바와 같이 20,000 MFI 이상의 반응을 보여 예상된 결과를 나타냈습니다.

r and d systems 검출 항체 대신 Millipore의 검출 항체를 Xap 분석에 사용했을 때, 반응 값은 RD systems 검출 항체로 얻은 반응 값의 약 30% 수준이었습니다. 이 차트의 녹색 선은 ELISA 표준 곡선을 나타내며, 제조사 권장 TNF alpha 범위는 16 내지 1000 pg/mL였습니다. 분광광도계의 한계로 인해 ELISA 분석의 범위를 넓히는 것은 불가능했습니다.

또한, 두 방법의 다이나믹 레인지와 민감도는 로그 스케일로 도식화했을 때 더 잘 나타납니다. EISA 반응의 기울기와 xap 분석의 반응 사이의 명확한 차이를 확인할 수 있으며, 이는 고농도와 저농도 모두에서 ELISA의 TNF alpha 검출 능력이 더 제한적임을 추가로 보여줍니다. 두 가지 기능적 TNF alpha xap 분석의 검출 한계 또는 LOD는, 6회 반복 실험에서 얻은 배경값의 표준편차(SD)의 3배를 더한 값보다 높은 반응 수준이 관찰된 가장 낮은 TNF alpha 농도를 확인하여 근사치로 구하였습니다.

여기에서 R&D Systems 쌍을 사용했을 때, 가장 낮은 TNF alpha 농도인 3.91 pg/mL에서 66 MFI의 반응이 나타났으며, 이는 배경값에 3 SD를 더한 기준치보다 높음을 관찰할 수 있습니다. Millipore 검출 항체를 R&D Systems 포획 항체와 함께 사용했을 때, 검출 한계는 7.81 pg/mL 미만이었습니다.

이 경우, 두 번째로 낮은 TNF alpha 농도는 17 MFI의 허용 가능한 반응을 생성했으며, 이는 가장 낮은 TNF alpha 농도의 반응에 해당 표준 편차의 3배를 더한 값보다 컸습니다. 이와 유사하게, r and d systems duo set Eliza의 검출 한계는 63에서 31 picograms per milliliter 사이로 추정되었습니다. 이 절차에 따라, xap assay를 더욱 최적화하기 위해 다양한 샘플 매트릭스나 리포터 내 항체 농도를 테스트하는 것과 같은 다른 단계들을 수행할 수 있습니다.