에서 Hypoxia의 효과를 연구하기 위해 정의된 기체 환경 만들기

본 실험의 목적은 연속 흐름법(continuous flow method)을 이용하여 저산소 챔버(hypoxia chamber)를 구축하고 유지하는 것입니다. 이를 위해 실험 절차에 필요한 튜브, 플라스크 및 챔버를 확보하고 제작합니다. 그 다음 단계로, 산소 탱크를 연결하고 유량을 선택하여 원하는 수준의 저산소 상태를 조성합니다.

탈이온수로 채워진 버블 플라스크에 가스를 통과시켜 가스를 가습합니다. 가습된 가스를 저산소 챔버에 연결하고, 테스트 샘플을 챔버에 넣어 저산소 조건에 노출시킵니다. 성체까지의 생존력을 관찰하여 저산소 상태에서 Hi F1 의존적 배아 치사율이 나타남을 확인합니다.

글러브 박스와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 연구실에서 제작하기 쉽고 비용이 저렴하며, 환경 챔버 내 가스 농도를 정확하고 재현 가능하게 제공한다는 점입니다. 이 방법은 선충인 C elegance의 저산소 반응에 대한 통찰을 제공하지만, 더 큰 모델 생물체나 세포 배양을 포함한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 또한, 이산화탄소 및 황화수소를 포함한 다른 가스들을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.

본 프로토콜에서는 저산소 챔버를 구축하는 방법을 설명합니다. 가스는 산소 농도가 지정된 압축 가스 탱크에 저장되며, 여기에 2단 레귤레이터가 부착됩니다. 가스는 유량 튜브의 하단으로 유입되어 적절한 유량으로 상단으로 배출됩니다.

그런 다음 가스가 버블 플라스크로 흘러 들어가 가스가 가습됩니다. 가습된 가스는 유입 밸브를 통해 저산소 챔버로 들어가 샘플을 저산소 상태에 노출시킵니다. 가스는 최종적으로 챔버에 뚫린 배기 구멍을 통해 실내로 배출됩니다.

Pyrex 결정화 접시 또는 애로우 팩(arrow pack) 상자를 환경 챔버의 본체로 사용할 수 있습니다. 용기의 부피는 최소한으로 유지해야 하며, 재질은 가스가 투과되지 않는 것이어야 합니다. 탄소 또는 다이아몬드 팁 드릴을 사용하여 용기의 한쪽 면에 구멍을 뚫고, 플라스틱 호스 바브 피팅(hose barb fitting)을 장착합니다.

에폭시를 박스와 피팅에 도포하기 전에 혼합하십시오. 그 다음 용기의 반대편에 첫 번째 구멍에서 떨어진 위치에 두 번째 구멍을 뚫어 동일한 절차를 반복하십시오. 난류 혼합을 증가시키려면 외경 1/8 inch의 FEP 또는 나일론 튜브를 사용하여 압축 가스 탱크를 질량 유량 제어기(mass flow controller) 또는 로토미터(rotor meter)와 같은 유량 제어 장치에 연결하십시오.

가스 탱크는 산소 함량 또는 무산소 조건에 대해 인증된 표준에 따라 질소와 균형을 이룬 정의된 산소 농도를 가져야 합니다. 순수 질소의 경우, 2단 레귤레이터를 사용하고 2단 압력을 원하는 압력으로 설정하십시오. 적절한 유량 선택에 대해서는 서면 프로토콜의 지침을 참조하십시오.

그 다음, 2단 레귤레이터의 튜빙을 챔버로 유입되는 가스의 유량을 제어하는 유량 조절 튜브(flow tube)에 연결합니다. 유량 조절 튜브의 배출구는 증류수가 담긴 소결 유리 필터 실린더가 포함된 가스 세척병에 연결합니다. 그 후, 세척병 반대편의 튜빙을 환경 챔버의 피팅 중 하나에 연결합니다.

이렇게 하면 환경 챔버로 유입되는 가스가 가습됩니다. 진공 그리스를 사용하여 챔버를 밀봉하십시오. 그런 다음 챔버 뚜껑 위에 무게추를 올려 기밀 상태를 유지하십시오.

장갑을 낀 손바닥에 소량의 물을 담아 챔버의 가스 배출구 피팅 부분에 대고 기포가 발생하는지 확인하여 밀봉 상태를 테스트합니다. 먼저, 동기화된 sea Elgan 개체군을 생성합니다. 1~100마리의 GR 성체를 균이 접종되지 않은 선충 성장 배지 플레이트 표면의 알칼리성 표백제 용액 한 방울 위에 놓습니다.

최소 8시간의 배양 기간 후 표백액 솔루션이 플레이트에 흡수되도록 합니다. 동기화된 L1 유충을 살아있는 OP50 박테리아가 접종된 플레이트로 옮깁니다. 또는, GRA 성충이 2~3시간 동안 플레이트에 알을 낳게 하여 동기식으로 발달할 웜 그룹을 생성하거나, 어린 배아를 수집하기 위해 혼합 집단에서 L4 유충을 선택합니다.

2~4세포 단계에서, 소량의 물 속에서 면도날을 사용하여 GR 성체를 다진 후, 마우스 피펫으로 배아를 옮기고, 이어서 저산소 조건에 노출시키기 위해 웜을 플레이트로 옮깁니다. 웜이 아가 플레이 표면 밖으로 탈출하는 것을 방지하기 위해, 플레이트 가장자리를 따라 10 mg/mL palmitic acid 에탄올 용액을 링 모양으로 도포합니다.

팔미트산이 용액에서 석출될 것입니다. 에탄올이 증발하며 균일성을 보장하는 물리적 장벽을 형성하므로, 환경 챔버에 넣기 전에 가스 세척병의 물을 반드시 교체하십시오. 벌레를 플레이트로 옮긴 후, 플레이트를 환경 챔버 내에 밀봉하고 가스 흐름을 시작하며, 분석에 필요한 시간 동안 노출 상태를 유지하십시오.

배아가 성체까지 생존하는지 확인하기 위해, 실온 공기로 복귀시킨 후 48시간 동안 벌레를 배양합니다. 이 시점에서 벌레들은 4단계 유충 또는 1일 차 성체 상태여야 하며, 성체까지의 생존율을 측정합니다. 저산소 노출 상태의 벌레를 시각화하려면, 22mm 정사각형 커버슬립 위의 M9 한 방울로 벌레를 옮기고, 필요한 경우 M9에 희석된 2% agarose 패드 위에 뒤집어 놓습니다.

마취제로 25 millimolar amol 또는 10 millimolar sodium azide를 사용할 수 있습니다. 또는 저산소증에 노출시킨 후, 투명 환경 챔버를 해부 현미경 스테이지 위에 직접 놓을 수 있습니다. 전체 가스 흐름 설정 장치를 포함한 모습과 그렇지 않은 모습의 두 가지 뷰가 제시되어 있습니다.

다른 하나는 챔버만 현미경 스테이지 위에 올린 상태입니다. 대부분의 벌레가 GR 성체가 될 때까지 10 cm 높이의 배양 플레이트 4개에서 Bristol N 2 벌레를 배양합니다. 1:5 알칼리성 표백제 용액을 사용하여 벌레들을 15 mL 원추형 튜브로 씻어 옮긴 후, 벌레들이 녹기 시작할 때까지 회전시키며 배양합니다.

5분 이내로 수행합니다. M9 버퍼로 벌레를 3회 세척하며, 각 세척 단계 사이에 1,500 ×g로 원심분리하고 플레이트가 깨지지 않도록 주의합니다. 표백된 배아를 8개의 150mm NGM 플레이트에 나누어 담고, 배아가 L4 유충으로 발달할 때까지 약 48시간 동안 배양합니다.

22 °C에서 플레이트를 환경 챔버로 옮기고, 4시간 또는 실험 설계에서 지정한 시간 동안 저산소 및 무산소 조건에 노출시킵니다. 샘플을 수확하려면 저산소 챔버의 뚜껑을 빠르게 엽니다. 샘플 플레이트 하나를 꺼낸 후 즉시 챔버를 다시 밀봉하고 해당 단계를 기록합니다.

저산소 상태에서 벌레를 제거한 후, 이 모든 과정은 2분 이내에 완료되어야 합니다. 증류수를 사용하여 벌레를 나일론 필터로 씻어낸 다음, 1% SDS 100 µL가 들어 있는 라벨이 부착된 15 mL 원추형 튜브에 붓습니다. SDS가 들어 있는 벌레를 벤치탑 원심분리기에서 1,500 ×g로 15~20초 동안 원심분리합니다.

휴지기를 갖고, 진공 장치를 사용하여 튜브 내의 상층액 대부분을 제거하되, 웜 펠렛(worm pellet)은 건드리지 않도록 합니다. 피펫을 사용하여 웜 펠렛을 미리 정해진 부피의 액체와 함께 라벨이 부착된 1.5 µL 마이크로 튜브로 옮깁니다. 샘플을 SDS page에 사용할 예정이라면, 이 튜브에 동일한 부피의 2배 농도 단백질 로딩 염료를 넣을 수 있습니다. 튜브를 밀봉하고 액체 질소에 담급니다.

모든 샘플이 분리될 때까지 반복하십시오. 일관성을 위해 하우스 공기 대조군 샘플에 대해서도 동일한 절차를 따르십시오. 샘플은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 이 그림은 1000 ppm 산소, 5,000 ppm 산소 및 약 210,000 ppm 산소의 정상 산소 상태(normoxia)에 노출된 배아의 생존력을 보여줍니다.

배아를 연속 흐름 산소 챔버 내의 각 조건에 24시간 동안 노출시킵니다. 벌레를 정상 산소 조건으로 옮겨 48시간 동안 성체로 발달시킨 후, 성체까지의 생존력을 측정합니다. 이 절차 이후, Western blot, QPCR 또는 수명이나 자손 생산과 같은 생리학적 분석을 위한 후속 분석용 샘플을 수집할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 귀하의 실험실에 연속 흐름 저산소 챔버를 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.